王文康 许立新 阮祥才 郑彬 林涛 应彦璐 李恒昌

双孔钾离子通道TRESK 在脊髓背根神经节广泛表达，除了维持神经元静息膜电位及神经递质的释放，还介导了脊髓水平神经病理性疼痛的发生，但具体机制不明确，TRESK 可被谷氨酸激活，但对脊髓神经元的作用不详[1-2]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，在表观遗传、细胞周期和细胞分化等调控中发挥重要作用[3-4]。本研究观察谷氨酸对大鼠脊髓神经元TRESK 的效应，通过基因芯片技术，检测脊髓神经元TRESK 变化对lncRNA 表达谱的影响，探讨TRESK 是否通过lncRNA 作用于下游信号通道发挥生物功能，为阐明脊髓神经元TRESK 在神经病理性疼痛中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物和材料 动物为原代SD 大鼠，体质量180～250 g。主要材料：大鼠脊髓背角神经元（ScienCell，M1580-57）、神经元培养基（ScienCell，1521）、倒置光学显微镜（奥林巴斯，CKX41）、细胞恒温培养箱（赛默飞，HERAcell150i）、lncRNA定量试剂盒（日本Takara 公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脊髓神经元培养 在无菌解剖液的平皿内分离脊髓，0.25%胰蛋白酶经37 ℃消化并吹打，吸取细胞悬浮液移置培养皿中。过滤及沉淀后加入3 mL 的培养基，稀释计数后以5×105个/mL将细胞接种于经多聚赖氨酸处理的1×106个/孔，500 µL/ 孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，1 d后更换饲养培养液。4 d 后于培养液内加入阿糖胞苷4 µg/mL，用于抑制非神经细胞增殖，培养7 d后进行实验。

1.2.2 实验分组和处理 培养原代大鼠脊髓神经元细胞，接种于培养皿中，采取随机分组法，将其分为4 组：空白组（不进行任何处理）、谷氨酸（Glu）组（谷氨酸100 µmol/L 处理24 h）、Glu+NC siRNA组（siRNA 空白质粒转染后同Glu 组方法处理）与Glu+TRESK siRNA 组（TRESK siRNA 转染后同Glu组方法处理）。各组按照上述方法处理结束后，免疫印迹法和RT-PCR 分别检测各组神经元的TRESK蛋白和mRNA 表达。

1.2.3 免疫印迹法 裂解细胞，离心后取上清液，用BCA 法测定蛋白浓度。蛋白上样后电泳完毕，将蛋白转移到PVDF 膜上（4 ℃、400 mA 恒流条件下120 min），室温封闭PVDF 膜1 h（含5%脱脂牛奶的TBST 溶液），加抗4 ℃过夜；TBST 洗膜，加入辣根过氧化物酶偶联二抗（1∶5 000），室温下孵育2 h，TBST 洗膜3 次。采用ECL 试剂进行显色反应后暗室内曝光显影。

1.2.4 RT-PCR 检测 谷氨酸处理24 h 后检测脊髓神经元TRESK mRNA 表达。脊髓神经元离心匀浆，弃细胞上清液，用PBS 液润洗细胞，采用Trizol 试剂盒提取总RNA，RNA 逆转录获得cDNA。0.5 µg/µL寡脱氧核苷酸（Oligo dT）1 µL 和总RNA 2.0 µg加入PCR 小管中，补充焦碳酸二乙酯（DEPC）水至9 µL；混匀后离心，70 ℃温浴10 min 后，立即置于0 ℃冰水混合物中冰浴，使Oligo dT 和模板退火，反应体系为：5×RT 缓冲液4.0 µL，10 mmol三磷酸脱氧核苷。

1.2.5 基因芯片检测 检测谷氨酸+TRESK siRNA与谷氨酸+NC siRNA 两组lncRNA 表达谱变化，从总RNA 中移除rRNA 后，得到mRNA；使用随机引物方法将每个样品放大并转录成带荧光的cRNA；使用纯化标记的cRNAs，并用NanoDrop ND-1000 检测浓度和活性。洗涤、固定并扫描杂交芯片。lncRNA谱包含探针原始信号的txt 文件导入到GeneSpring GX v12.1 软件，标准化后，去除低质量探针，得到lncRNA 表达信息。利用Fold change 进行差异lncRNA 筛选，默认Fold change≥2.0，并根据lncRNA与蛋白编码基因在基因组上的相对位置关系。

1.2.6 基因本体（GO）分析及KEGG 通路富集分析 GO 分析是采用Gene Ontology 数据库对差异表达lncRNA 进行功能注释，统计每个基因功能中存在的基因数量。KEGG 通路富集分析是基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库来了解差异表达的lncRNA 富集的生物信号通路。分析后计算每个基因功能中差异基因的富集值，富集值越大，表示该基因功能或信号通路受到实验影响越大。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（）表示，两两比较采用t 检验，多组比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 谷氨酸对TRESK siRNA 转染大鼠脊髓神经元TRESK 表达情况 与空白组比较，Glu 组和Glu+NC siRNA 组TRESK 蛋白及mRNA 表达均明显上调（P＜0.05）；与Glu+NC siRNA 组相比，Glu+TRESK siRNA 组脊髓神经元TRESK 蛋白及mRNA 表达均明显下调（P＜0.05）。见表1。

表1 谷氨酸对TRESK siRNA转染大鼠脊髓神经元TRESK表达情况（）

表1 谷氨酸对TRESK siRNA转染大鼠脊髓神经元TRESK表达情况（）

注：* 与空白组相比，P＜0.05；# 与Glu+NC siRNA 组相比，P＜0.05。

2.2 谷氨酸诱导神经元TRESK 中lncRNA 差异表达结果 本次实验中共检测lncRNA 基因经聚类分析得出，与Glu+NC siRNA 组比较，Glu+TRESK siRNA 组出现lncRNA 差异表达基因322 条，其中212 条基因表达上调，110 条基因表达下调。所有表达差异的lncRNA 基因中，uc007pgs.1 基因表达上调倍数最多，约为41.61 倍；而表达下调倍数最多基因为ENSMUST00000161848，约为6.97 倍。其中表达上调及下调差异倍数最大的前5 条lncRNA差异表达。见表2。

表2 Glu+NC siRNA组与Glu+TRESK siRNA组部分lncRNA基因差异表达

2.3 lncRNA 差异表达基因生物信息分析 GO 分析结果显示，lncRNA 差异表达的靶基因功能更多与炎症反应、凋亡过程及生物过程等有关，见图1。KEGG 富集通路分析结果显示，差异显著的lncRNA 基因调控的靶基因主要参与mTOR 信号通路、蛋白激酶信号通路和GRCP 信号通路等下游通路，见图2。

3 讨论

图1 GO富集分析

图2 KEGG富集通路分析

神经病理性疼痛是临床中常见慢性疼痛，其形成及病程发展机制或经多种神经递质参与，发病机制较为复杂。文献[5-6]报道，谷氨酸可诱导脊髓神经元TRESK 凋亡，且与慢性疼痛的发生机制密切相关。而神经病理性疼痛的病理过程涉及大量细胞分子的变化，许多研究证实了lncRNA 可调节编码基因的表达，从而影响神经发育，且富集于大鼠中枢神经，密切参与许多神经系统性疾病[7-8]。因此，通过研究脊髓神经元TRESK 的变化及其lncRNA 差异表达情况，分析差异基因参与机制和信号通路分析，进一步阐明神经病理性疼痛的病理过程。

在本次研究中，大鼠脊髓神经元TRESK 经谷氨酸之后其mRNA 和蛋白表达量上调，TRESK siRNA 转染后，Glu+TRESK siRNA 组相比较于Glu+NC siRNA 组，脊髓神经元的TRESK 蛋白及mRNA 表达明显下调，说明谷氨酸对TRESK 具神经元突触及功能调控作用，与文献[9-10]研究报道结果相符。通过谷氨酸处理神经元TRESK 蛋白24 h之后的lncRNA 进行基因芯片高通量测序，以筛选差异倍数最大且差异显著基因322 条，其中212 条基因表达上调，110 条基因表达下调，这些差异表达lncRNA 基因或与神经元TRESK 参与神经病理性疼痛的生物功能进程有关[11]。为进一步发掘lncRNA 显著差异表达靶基因的潜在作用和效应功能，进行了GO 富集分析和KEGG 富集通路分析，其中当富集值越大是，其代表差异基因参与生物过程和涉及信号通路更密切[12-13]。结果在GO 富集分析中，差异显著的靶基因更多富集于炎症反应、凋亡过程及生物过程等，提示这些差异显著的靶基因可促进分子结合与分化和信息传导，当减少神经元凋亡可印制伤害信息传导，致脊背根神经节向脊髓传导痛觉伤害性神经元的兴奋增高，进而产生痛觉反应，表明lncRNA 或参与神经功能行使[14-16]。KEGG 富集通路分析可以发现，PI3K-AKT 信号通路有许多功能，差异显著的lncRNA 靶基因主要涉及mTOR 信号通路、蛋白激酶信号通路和GRCP 信号通路等下游通路，表明神经元TRESK 中差异表达的lncRNA 可能通过以上信号通路直接或间接参与神经病理性疼痛病程发展[17-20]。然而对于差异lncRNA 在上述信号通路的调控机制仍有待进一步研究，且本研究仅探讨lncRNA 表达谱的差异，对于共表达的mRNA 在神经元TRESK 的生物学功能未深入展开分析。

综上，谷氨酸诱导神经元TRESK 中相关lncRNA 表达谱发生差异，从而引起细胞炎症反应和神经元凋亡，其中mTOR 信号通路、蛋白激酶信号通路和GRCP 信号通路可能是主要的靶点信号通路，以期为阐明临床中神经病理性疼痛的发病机制提供理论性参考依据。