柯 波 俞菊红 涂俐嫣 程洪波

1.江西省人民医院血液内科，江西南昌 330006；2.江西省人民医院医学影像科，江西南昌 330006

高三尖杉酯碱（HHT）是从我国特有植物海南粗榧中提取出一种生物碱，其具有明显的抗肿瘤作用，主要用于慢性粒细胞白血病（CML）和急性髓系白血病（AML）的治疗［1-3］。2010 年HHT 被美国食品药品监督管理局批准用于难治/复发性CML 的治疗［4］。HHT的抗白血病作用机制复杂，主要表现为抑制蛋白合成，特别是抗凋亡和细胞增殖相关蛋白，例如X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）、髓细胞白血病因子1（Mcl）和Myc原癌基因（cMyc）等［5-6］。HHT 发挥其生物学功能的一个潜在机制是通过其与核糖体A 位点的结合，从而抑制蛋白质的合成［7］，还可以与转录因子结合，通过抑制TET 蛋白1（TET1）和FMS 样酪氨酸激酶3（FLT3）的表达影响白血病细胞的增殖［8-9］。然而，目前尚不清楚HHT 是否有其他抗白血病作用的潜在机制。本研究通过HHT 作用于人白血病K562 细胞，分析其对细胞增殖和DNA 损伤相关蛋白表达的影响，探究其可能作用的信号通路机制，为CML 临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

人白血病K562 细胞由实验室保存。HHT 为杭州民生药业公司产品（17021819）；胎牛血清（11011-8611）、RPMI-1640 培养基（31800-500）和PBS 磷酸缓冲液（P1031）购于北京索莱宝公司；细胞培养板和细胞培养瓶购于无锡NEST 公司；兔抗人磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，ab181602）、兔抗人细胞周期蛋白D1（CyclinD1，ab134175）、兔抗人核蛋白MKI67（Ki-67，ab16667）、兔抗人组蛋白H2AX 的磷酸化（γ-H2AX，ab81299）、磷酸化兔抗人毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白激酶（p-ATM，ab81292）单克隆抗体均购于美国Abcam 公司；羊抗兔标记辣根过氧化物酶（HRP）二抗购于北京索莱宝公司（SE134）。BeyoECL Star 化学发光试剂盒（P0018AS）购于上海碧云天生物技术有限公司；倒置光学显微镜购于江南公司（XD-202）；CO2细胞恒温培养箱购于日本三洋公司（MCO175）；酶标仪购于深圳雷杜公司（RT6100）；电泳仪（PowerPac HC）和转膜仪（Trans-blot SD）购于美国Bio-Rad 公司；化学发光成像系统购于上海勤翔科学仪器公司（ChemiScope6000）。

1.2 细胞培养与分组

人白血病K562 细胞培养于含10%胎牛血清RPMI-1640 培养液中，37℃，5% CO2细胞培养箱中常规培养，待细胞长至对数生长期时用于本研究。将其分为HHT 组和对照组，HHT 组又分为5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L 不同浓度的HHT 亚组。

1.3 CCK-8 细胞增殖检测

选取对数生长期的K562 细胞，按5×105个/mL 的细胞密度接种于96 孔板中，HHT 组分别加入不同浓度的HHT（5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L），培养48 h 后，每孔中加入10 μL CCK-8试剂，培养1 h 后用酶标仪检测450 nm 处的OD 值，每组设置6 个复孔。细胞增殖抑制率=（1-实验组OD 值均值/对照组OD值均值）×100%。

1.4 Western blot 检测细胞中Cyclin D1、Ki-67、γ-H2AX 和p-ATM 蛋白表达水平

取对数生长期的K562 细胞，按5×105个/mL 的细胞密度接种于6 孔板中，HHT 组分别加入不同浓度的HHT（5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L），常规培养48 h 后收集细胞，加入裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 提取细胞全蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。取20 μg 的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，于5%的脱脂奶粉中室温封闭2 h；4℃条件下一抗孵育过夜，次日将膜用含吐温磷酸缓冲液（PBST）漂洗4 次，10 min/次；用HPR二抗室温振荡孵育2 h；PBST 漂洗4 次，10 min/次；配置化学发光反应液并孵育PVDF 膜，于化学发光成像系统中拍照，用软件分析目的蛋白条带与内参条带光密度比值，得出目的蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

数据采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间的差异比较采用LSD-t检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HHT 抑制K562 细胞增殖

CCK-8 方法检测结果显示，HHT 处理细胞48 h 后可对K562 细胞增殖产生明显的抑制作用。不同浓度（5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L）的HHT 对K562细胞增殖抑制率分别为（4.70±0.45）%、（9.80±0.35）%、（34.00±0.29）%和（41.00±0.64）%；随着HHT 浓度增加抑制效应逐渐增强。

2.2 HHT 对细胞增殖相关蛋白表达的影响

与对照组比较，5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L HHT 组均可下调Cyclin D1 蛋白，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。与对照组比较，5×10-8、1×10-7mol/L HHT 组Ki-67 蛋白表达水平明显下调，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见图1。

2.3 HHT 对DNA 损伤相关蛋白表达的影响

Western blot 检测结果显示，与对照组比较，5×10-8、1×10-7mol/L HHT 组可诱导γ-H2AX 蛋白表达上调，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。与对照组比较，1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L HHT 组可上调p-ATM 水平，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。见图2。

3 讨论

AML 是一种恶性血液肿瘤，化疗为其主要治疗手段之一。HHT 在我国较早用于白血病的治疗，其与柔红霉素、阿霉素和阿糖胞苷联合用于一线治疗［10-11］。基于HHT 的化疗策略，在治疗AML 患者初期方面表现出良好的效果，HHT 单独治疗可有效抑制AML 细胞的体外生长和存活，并可限制AML 患者的疾病进展，这种抑制作用主要归因于HHT 诱导的细胞周期阻滞和抑制细胞增殖，以及增强髓系细胞的分化［12］。

图1 不同浓度HHT 对K562 细胞中增殖相关蛋白表达的影响

图2 不同浓度的HHT 对K562 细胞中DNA 损伤相关蛋白表达的影响

HHT 可以通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制抗凋亡蛋白Bcl-6 的表达，诱导K562 细胞凋亡［13］，HHT 还可以诱导耐药的K562细胞发生自噬以及BCR-ABL 融合蛋白的泛素化降解［14］。本研究发现不同浓度HHT 均可抑制K562 细胞的增殖，HHT 还可以通过降低线粒体膜电位诱导细胞凋亡［15］。Western blot 实验结果显示在5×10-8mol/L和1×10-7mol/L 浓度HHT 处理的K562 细胞中，细胞增殖相关核抗原Ki-67 的表达水平明显下调，不同浓度的HHT 处理还可下调Cyclin D1 的表达水平，Cyclin D1 主要参与G1/S 细胞周期进程的调控，在多数肿瘤细胞中出现上调表达［16］。研究结果提示HHT 抑制K562 细胞增殖可能与Ki-67 和CyclinD1 的下调表达有关。

在白血病的临床治疗中，蒽环类药物和拓扑异构酶抑制剂药物均可诱导细胞DNA 损伤和细胞凋亡。然而，HHT 是否具有诱导DNA 损伤作用尚未报道，本研究通过Western blot 分析，HHT 处理的K562 细胞中磷酸化组蛋白γ-H2AX 的表达上调，γ-H2AX 是一种DNA 损伤标志物，主要参与DNA 损伤应答过程［17-18］。ATM 作为DNA 损伤的 “感应器” 监视细胞DNA 损伤，ATM 发生自磷酸化激活并作为激酶磷酸化其底物细胞周期检测点激酶2（Chk2），启动DNA 损伤应答进程［19-20］。因此，本研究还分析了ATM 的磷酸化水平，结果发现HHT 处理的K562 细胞中ATM 磷酸化水平明显上调，提示HHT 处理的K562 细胞出现DNA 损伤，并激活DNA 损伤应答过程。

尽管治疗所诱导的DNA 损伤广泛存在，但是白血病细胞利用其DNA 损伤修复机制促使CML 的急变期转化，并诱导细胞耐药［21-22］。有研究发现HHT 联合增强慢性粒细胞白血病对伊马替尼的敏感性［23］，HHT 可以诱导SMAD 家庭成员3（smad3）蛋白的磷酸化并激活转化生长因子-β（TGF-β）信号途径，导致白血病细胞G1期阻滞和细胞凋亡［24］。HHT 还可以通过抑制信号传导与活化转录因子3（STAT3）和核因子-кB（NF-κB）等多种信号途径，协同化疗药物增强敏感性［25-26］。综上所述，HHT 对白血病K562 细胞的增殖具有抑制作用，并且可以诱导DNA 损伤，可能是HHT发挥其抗白血病作用的机制之一。