方贤磊 曾丽平 李 娜 向 莎 伍世挥 卢小敏 张 畅 梁 露

1.湖南医药学院第一附属医院病理科，湖南怀化 418000；2.湖南医药学院医学院，湖南怀化 418000

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率位居全球恶性肿瘤第四位，死亡率第二位，严重危害人们的健康［1］。探讨结直肠癌的发病机制，寻找有效的防治方法具有重要的临床和现实意义。肿瘤的发病机制复杂，涉及多个方面，与机体的免疫应答密切相关［2-4］。辅助性T（Th）细胞在免疫应答过程中起着重要的作用，其主要分为两类，即Th1 细胞亚群和Th2 细胞亚群，其中Th1 细胞主要分泌γ 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-12、IL-17 等细胞因子，参与细胞免疫应答，在肿瘤发生及抗肿瘤免疫过程中起重要作用，而Th2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、和IL-10 等细胞因子，通过刺激B 淋巴细胞产生免疫球蛋白来介导体液免疫反应［5-7］。正常状态下，机体Th1 和Th2 细胞保持动态平衡，以保证机体发挥正常的免疫功能，而近年来有研究显示［8-10］，在肿瘤的发生发展过程中，Th1/Th2 细胞之间的平衡很可能被打破，变成Th2 细胞占主导地位，导致免疫应答失衡。本研究采用免疫组织化学法检测结直肠癌组织中Th1 细胞因子IFN-γ 与Th2 细胞因子IL-4 的表达情况，并探讨其与患者临床分期进展的关系。

1 材料与方法

1.1 样本收集

收集2016 年1 月—2018 年8 月湖南医药学院附属第一医院收治的61 例结直肠癌患者的肠组织标本为结直肠癌组，其中男37 例，女24 例；年龄20～68 岁，平均（50.0±8.2）岁。按照临床分期，将其分为临床Ⅰ期16 例，临床Ⅱ期20 例，临床Ⅲ期15 例，临床Ⅳ期10 例。另收集各期患者距离癌组织边缘外10 cm的癌旁组织各5 例（共20 例）为对照组。本研究经湖南医药学院医学伦理委员会批准，所有纳入研究的患者均签署了知情同意书。

1.2 方法

所有样本行组织切片，经HE 染色做病理确诊，并综合临床分期，然后采用免疫组织化学法（SP 法）检测各组组织中IFN-γ（北京中杉金桥生物技术有限公司，TA320356）和IL-4（北京中杉金桥生物技术有限公司，TA320372）的表达情况，DAB 显色以后细胞内出现棕黄色或棕黄色颗粒为阳性诊断标准。利用Image-Pro Plus 6.0 软件分析每张图片中阳性染色部分的平均积分光密度值（MIOD）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计学软件对所得的数据进行分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSDt 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-γ 和IL-4 在不同分期结直肠癌组织中的表达情况

细胞因子IFN-γ 和IL-4 在结直肠癌病灶组织和癌旁肠黏膜组织中均有表达，主要分布在胞质内。肿瘤分期越高，IFN-γ 表达的阳性程度越弱；肿瘤分期越高IL-4 的阳性越强。见图1～2（封四）。

图1 IFN- y在不同分期结直肠癌组织中的表达情况(SP ,400x)

图2 IL- 4在不同分期结直肠癌组织中的表达情况(SP，400x)

2.2 不同分期结直肠癌组织中IFN-γ、IL-4 MIOD 值比较

临床Ⅳ期结直肠癌组织IL-4 MIOD 值高于临床Ⅰ～Ⅲ期及对照组，临床Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌组织IL-4 MIOD 值高于临床Ⅰ期及对照组，临床Ⅰ期结直肠癌组织IL-4 MIOD 值高于对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；临床Ⅳ期结直肠癌组织IFN-γ MIOD值低于临床Ⅰ～Ⅲ期及对照组，临床Ⅲ期结直肠癌组织IFN-γ MIOD 值低于临床Ⅰ～Ⅱ期及对照组，临床Ⅱ期结直肠癌组织IFN-γ MIOD 值低于临床Ⅰ期及对照组，临床Ⅰ期结直肠癌组织IFN-γ MIOD 值低于对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）。

表1 不同分期结直肠癌组织中IFN-γ 和IL-4 MIOD 值比较（）

表1 不同分期结直肠癌组织中IFN-γ 和IL-4 MIOD 值比较（）

注：与对照组比较，*P ＜0.05；与Ⅰ期比较，☆P ＜0.05；与Ⅱ期比较，△P ＜0.05；与Ⅲ期比较，#P ＜0.05。IL-4：白细胞介素-4；IFN-γ：γ 干扰素

3 讨论

肿瘤相关的免疫反应与癌症的发生密切相关，免疫细胞和相关细胞因子在肿瘤的发生发展及治疗过程中起着重要作用［7-9］。CD4+T 细胞是效应T 细胞的重要组成部分，根据其分泌的细胞因子不同分为Th1、Th2、Treg 和Th17 细胞。Th1 细胞可分泌IFN-γ，激活B 淋巴细胞，促进抗体产生，其介导的免疫反应是细胞免疫的关键参与者［10］。Th2 细胞可通过独立于吞噬活性的机制杀死细胞外病原体，可分泌IL-4、IL-5 等细胞因子激活补体免疫反应，激活巨噬细胞，并能刺激B 细胞增强IgG 抗体的产生［5,11］。Th1/Th2 细胞免疫应答的抑制或功能失调可导致癌症进展，晚期癌症患者普遍存在细胞介导的免疫功能受损，其免疫应答主要为Th2 细胞［12］。侵袭性更强的肿瘤患者Th1/Th2 细胞比值较低，且Th1 细胞显性反应的患者5 年存活率更高，癌症的复发率更低［13-14］。因此，Th1/Th2 细胞平衡在肿瘤的发生发展中起重要作用，可作为肿瘤诊断、治疗及预后评估的生物标志。

本研究探讨了结直肠癌组织中Th1 细胞因子IFN-γ 和Th2 细胞因子IL-4 的表达情况及临床意义，发现癌组织中细胞因子IFN-γ 表达减少，而IL-4表达增加，与Walker 等［15］同类研究结果基本一致。在此基础上，进一步探讨了IFN-γ 和IL-4 的表达与结直肠癌患者临床分期的关系，发现结直肠癌组织中IFN-γ的表达水平较对照组明显降低，肿瘤分期高，IFN-γ 表达水平低；而结直肠癌组织中IL-4 的表达较对照组明显增高，肿瘤分期高，IL-4 的表达水平高，提示在结肠癌的发生发展过程中存在Th1/Th2细胞的失衡现象，平衡随肿瘤进展逐渐向Th2 细胞亚群偏移。Gonzalez-Gugel 等［16］研究发现结直肠癌患者外周血中细胞因子IL-6、IL-4 和IFN-γ 的表达水平与临床病理分期相关，且Th1 型细胞比例变化不大而Th2 细胞比例显著增多。这些研究结果提示Th1/Th2 细胞因子在体内的不平衡表达可以作为判断结直肠癌患者免疫功能转换、病情状态及预后情况的生物学指标。

尽管本研究初步证明结直肠癌组织存在Th1/Th2细胞因子的表达失衡，且与患者的临床病理分期相关。但由于方法学、样本量等方面的限制，本研究结果仍需设计更好、样本量更大的临床队列研究进行验证。本研究只停留在现象层面，对于Th1/Th2 细胞因子在肿瘤组织中失衡的具体原因、转化规律及在肿瘤发生发展过程中的具体生物学作用仍需深入研究，同时也是下一步的研究目标。Th1/Th2 细胞的动态平衡及细胞因子分泌情况是目前肿瘤发生机制和肿瘤免疫治疗领域的研究热点，Th1 型细胞介导的免疫应答在抑制肿瘤细胞生长过程中起着重要作用。维持Th1/Th2 细胞的正常平衡状态，诱导Th1 细胞的分化，有助于癌症患者免疫功能的恢复，促进对肿瘤细胞的免疫应答，提高抗肿瘤治疗效果。