陈文娟　吴以龙　丁其欢　毛林江　沈晓静　李兴玉　字成庭

摘要  采用不同乙醇提取时间，DMSO共沸收集-冷冻干燥制备咖啡因的方法，并用高效液相色谱检测、分析纯度。研究表明，95%乙醇提取3 h，DMSO共沸收集-冷冻干燥制备的咖啡因经高效液相色谱分析，纯度较高。用冷冻干燥方法制得咖啡因的最佳条件为10 g茶叶粉末，95%乙醇75 mL，提取时间2 h，DMSO共沸收集，冷冻干燥。

关键词  茶叶;咖啡因;提取;高效液相色谱

中图分类号  TQ914.1    文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2019）24-0174-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.052

Method for the Extraction of Caffeine from Tea

CHEN Wen-juan1，WU Yi-long1，DING Qi-huan2 et al  （1.College of Science，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201;2.College of Tea（Puer），West Yunnan University of Applied sciences，Puer，Yunnan 665000）

Abstract  In this study，DMSO azeotropic collection and freeze-drying were used to prepare caffeine in different ethanol extraction times，and the purity was detected and analyzed by HPLC.The research showed that the caffeine extracted by 95% ethanol for 3 h，DMSO azeotropic collection and freeze-drying was characterized with high purity by high performance liquid chromatography（HPLC）.We confirmed that the best condition for the preparation of caffeine by freeze-drying method was 10 g tea powder，75 mL 95% ethanol，3 h extraction time，DMSO dissolution and freeze-drying.

Key words  Tea;Caffeine;Extraction; HPLC

基金项目  国家自然科学基金青年基金项目（21602196）;云南省自然科学基金青年基金项目（2017FD084）;云南省农业基础研究联合专项面上项目（2017FG001〔-046〕）;云南农业大学青年自然科学基金青年基金项目（2015ZR08）。

作者简介  陈文娟（1996—），女，白族，云南大理人，从事茶叶研究与开发工作。*通信作者，李兴玉，博士，从事天然产物研究与开发工作;字成庭，博士，从事化学生物学研究。

收稿日期  2019-03-18

茶树是一种很古老的双子叶植物，茶叶主产于我国西南、华南、江南、江北等地区，有野生和栽培品种，资源相对充足。近年来对于茶叶中生物碱活性的研究不断有新的发现。茶叶中含有多种生物碱，咖啡碱是其中之一。

咖啡碱又称为咖啡因，咖啡因含量占茶叶干物质总量的2%～5%，其化学名称为1，3，7-三甲基-2，6-二氧嘌呤[1-2]。咖啡因分子式为C8H10N4O2，分子量是194.19。咖啡因的熔点在238 ℃，能溶于氯仿、丙酮、乙醇和水[3]。咖啡因具有抗衰老、利尿、强心、兴奋中枢神经等药理和生理作用[4]，应用前景广泛。利用茶叶原料提取咖啡因具有原料易得、环保等优点，

目前，从茶叶中提取咖啡因的方法主要有水提法、醇提法、有机溶剂提取法、升华法等[1]。但现有提取咖啡因方法因方法具有能耗大、产品收率低、产品纯度低等缺点[5]。如何方便、高效地从茶叶中提取咖啡因引起了人们的普遍关注。笔者采用不同乙醇提取时间，DMSO共沸收集咖啡因与DMSO的混合液，再用冷冻干燥制备咖啡因的方法，并用高效液相色谱检测、分析纯度，探讨在不同时间乙醇提取下，用DMSO共沸收集-冷冻干燥制备咖啡因的产率，分析所得咖啡因的纯度，在以往试验方法基础上提出一些改进，以达到更好的试验结果。

1  材料与方法

1.1  材料

烧杯、恒温水浴锅、100 mL单口圆底烧瓶、磁力攪拌子、油浴锅、25 mL圆底烧瓶、分析天平、Agilent 1260 高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、减压蒸馏装置、真空泵、数字显示熔点仪等;茶叶、95%无水乙醇、DMSO、甲醇（分析纯）、三氟乙酸、蒸馏水、咖啡因标准品。

1.2  方法

1.2.1  茶叶粉末的制备。

将晒干的干燥茶叶置于粉碎机内粉碎，放入烘箱内烘至恒重，取出后冷却至室温，得到茶叶粉末，放入烧杯中备用。

1.2.2  咖啡因的提取。

分别称取3份5 g的茶叶粉末，置于100 mL的单口圆底烧瓶中，加入75 mL 95%无水乙醇，分别编号为1、2、3。再放入85 ℃恒温水浴锅中，接上冷凝装置，连续提取1、2、3 h，完成后，微冷抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压蒸干回收。将得到的浓缩物用DMSO溶解，加入搅拌子，放在油浴锅中进行蒸馏，得到含有DMSO和咖啡因的混合液，收集混合液，冷冻干燥，收集所得到的咖啡因并称重。

1.2.3  薄层色谱层析试验。分别取1 mg/mL的3份样品和咖啡因标准品，用毛细管点样于10 cm×20 cm的薄层色谱（TLC）薄层板上，点样动作必须缓慢，每点一滴，需用吹风机吹干后方可再点样，使得点样面积控制在3～4 mm范围内;将预先配好的展开剂（石油醚∶乙酸乙酯=9∶1）倒入层析槽中，然后盖上玻璃盖，让其层析、展开;将层析后的TLC板取出，吹干后用波长为254 nm的紫外灯显色。

1.2.4  高效液相色谱检测条件。

Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相A（甲醇）-B（水）梯度洗脱（0～10 min，10%A∶50%A，10～20 min，50%A∶70%A，20～30 min，70%A∶90%A）;流速1 mL/min;柱温25 ℃;进样量5 μL;检测波长280 nm。

1.2.5  标准品溶液的制备。

精密称取咖啡因标准品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加少量甲醇超声溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的标准品储备液。

2  结果与分析

2.1  标准曲线绘制

取适量咖啡因标准品储备液置于HPLC进样瓶中，分别以进样量0.5、1、3、5、7 μL，按上述设定的色谱条件测定，得到峰面积值。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线（图1），计算回归方程，得到标准曲线回归方程：Y=0.040 5X+0.716 8（R2=0.999 7）。

2.2  提取时间对咖啡因产率的影响

根据上述试验方法，从茶叶中提取咖啡因的产率和提取时间如表1所示。随着提取时间的增加，咖啡因提取率并没有提高。所以，3 h是最佳的提取时间。

2.3  薄层色谱法检测对比分析

将干燥得到的咖啡因样品与标准品在10 cm×20 cm的薄层色谱（TLC）薄层板上，用毛细管点样，每块板上点3个样品（1，2，3）和标准品，用展开剂展开后再用波长为254 nm的紫外灯显色，得到薄层色谱检测分析结果。从图2可以看出，Rf标准品=Rf样品1=Rf样品2=Rf样品3=0.8，结果表明制取的咖啡因样品与标准品一致。

2.4  高效液相色谱检测对比分析

将干燥得到的咖啡因样品与标准品用高效液相色谱对比分析，结果如表2所示，可以看出咖啡因样品的纯度较高，其中样品3的纯度最接近标准品。图3是浓度为1 mg/mL咖啡因标准品和样品溶液的色谱图，可以看出3组样品1（t=10.989 min）、2（t=11.072 min）和3（t=10.972 min）的出峰时间与咖啡因标准品（t=10.933 min）出峰时间基本相同。结果表明，所制备的咖啡因具有较高的纯度。

2.5  熔点测定分析

将制备得到的咖啡因样品经数字显示显微熔点测定仪检测其熔点，并与咖啡因标准品对照，结果如表3所示。制取样品熔点与咖啡因标准品熔点相差0～2 ℃，表明制取的咖啡因样品符合GB 14758—2010《食品安全国家标准食品添加剂 咖啡因》，说明该研究提取的咖啡因为合格产品。

3  讨论与结论

3.1  讨论

3.1.1  咖啡因提取方法的选择。不同品种的茶叶具有不同的提取条件，如何做到从茶叶中提取出更多、更纯的咖啡因是一个值得研究的问题[6-8]。盛贻林等[1]对咖啡因的提取方法进行了对比，主要方法有醇提法、水提法、有机溶剂提取法，但多数提取方法最后都要用升华来得到咖啡因，而升华法对物质本身的温度要求较高，因此有一定的局限性。该研究浸提茶叶时不再使用索式提取器，直接接上冷凝管，在恒温水浴锅中回流，冷冻干燥法代替升华法，简化试验操作步骤，应用于咖啡因的提取中，具有短时、高效、环保等优点，同时得到纯度较高的咖啡因，提高咖啡因产量，符合绿色环保理念。张勇等[3]研究了5种咖啡因的提取方法，其中3种都是升华法得到咖啡因，操作步骤较繁琐，对温度要求较高。采用冷冻干燥法可以简化操作步骤，缩短时间，得到纯度较高的咖啡因。

3.1.2  咖啡因提取溶剂的选择。

咖啡因能溶于水、二氯甲烷、氯仿、乙醇、丙酮等多种溶剂。咖啡因提取方法有很多种，选择的提取溶剂也有多种。咖啡因提取应该选择操作步骤简单、试剂毒性小、仪器要求低、绿色安全的方法。氯仿等有机溶剂有毒、易燃、易挥发，价格比较高昂，操作不便，一般不选用[3，9]。曾有研究表明有人用丙酮提取咖啡因，得到的咖啡因产率比较高，纯度也较高[10]，但是丙酮有毒，对人伤害较大，不符合绿色理念和可持续发展的理论;水是提取咖啡因较好的溶剂，水提法对仪器要求低，操作步骤简单，时间短，并且经济、高效、环保，但提取产率比较低，咖啡因纯度不高;用乙醇作溶剂，无毒性，提取产率高。从安全、环保的角度出发，该研究選用95%乙醇水溶液作为提取咖啡因的溶剂。

3.1.3  咖啡因检测方法的选择。

咖啡因的检测方法有多种，常见的检测方法有红外光谱法、高效液相色谱法、气象色谱法、紫外可见分光光度计测吸光度法等。红外光谱法具有特征性强、测定快速、分析灵敏度高等特点，但是其对试样纯度要求较高，而且定量分析误差较大;高效液相色谱法具有分离效能高、灵敏度高、应用范围广、分析速度快、载液流速快等优点[9-13]，此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点。该研究采用高效液相色谱法来检测咖啡因。

该研究采用的方法：①缩短回流时间，以往试验要求回流时间达4～6 h，但根据实际情况，一般在2～3 h即可;②不再采用升华的方法，而采取冷冻干燥的方法得到咖啡因，简化操作步骤，更容易得到咖啡因;③用旋转蒸发仪减压蒸馏装置来回收乙醇，不仅缩短了蒸馏时间，还提高了溶剂的回收利用率;④较其他有机溶剂提取法，该试验方法所用溶剂毒性低，对环境友好。

3.2  結论

该研究不再采用索式提取器，将升华法改成直接冷冻干燥，得到咖啡因最佳的提取条件为10 g茶叶粉末，95%无水乙醇75 mL，提取时间2 h，DMSO共沸收集，冷冻干燥。试验效果明显，为今后的咖啡因提取提供了一定的指导作用。

参考文献

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[2]郭叶，郝鹤.从茶叶中提取咖啡因实验改进[J].包头医学院学报，2017，33（4）：111-112，118.

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[4]黄攀豪.茶叶中咖啡因的提取和分析[J].佛山科学技术学院学报（自然科学版），2008，26（2）：48-49.

[5]马媛媛.在茶叶成份中提取咖啡因的实验方法及改进[J].科技展望，2015，25（11）：77.

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