吴江花　张虹丽　师静蕊　李淑金

【摘要】 目的 探究米諾环素辅助治疗对慢性牙周炎患者外周血T细胞亚群及程序性死亡分子-1（PD-1）、程序性死亡分子-1配体（PD-L1）表达的影响。

方法 选择2014年10月～2016年10月接受治疗的96例慢性牙周炎患者作为本次研究对象，根据随机数字表将其分为对照组和治疗组，每组48例，对照组患者给予龈下刮治及根面平整治疗，治疗组患者在对照组治疗的基础上给予米诺环素进行辅助治疗，对比分析两组患者以及治疗组轻度、中度和重度患者外周血中CD4+、CD8+比例以及CD4+/CD8+、外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞PD-1及PD-L1的表达。

结果 治疗后3个月，外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明显低于对照组，CD8+比例明显高于对照组（P<0.001）;治疗组轻度、中度和重度患者外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明显降低，CD8+比例明显升高（P<0.001）。治疗后3个月，治疗组患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1、PD-L1表达水平均明显低于对照组（P<0.001）;治疗组轻度、中度和重度患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1、PD-L1表达水平均明显降低（P<0.01或0.001）。

结论 米诺环素辅助治疗可明显降低慢性牙周炎患者外周血中CD4+比例，有效提升CD8+比例，并抑制PD-1和PD-L1的表达。

【关键词】 米诺环素;慢性牙周炎;T细胞亚群;程序性死亡分子-1;程序性死亡分子-1配体

中图分类号：R781.4+2 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.11.006

Effect of Minocycline adjuvant therapy on levels of T Cell subsets in peripheral blood and expression of PD-1， PD-L1 of patients with chronic periodontitis

WU Jianghua1，ZHANG Hongli2，SHI Jingrui2，LI Shujin3

（1.Department of Periodontal Membrane，2.Department of Oral Medicine，3.Department of Oral Medicine，the Second Affiliated Hospital of Pingdingshan University and Stomatological Hospital of Pingdingshan，Pingdingshan 467000，China）

【Abstract】 Objective To explore the effect of minocycline adjuvant treapy on levels of T Cell subsets in peripheral blood and expression of programmed death-1（PD-1） and programmed death ligand-1（PD-L1） of patients with chronic periodontitis.

Methods 96 patients with chronic periodontitis treated in our hospital from October 2014 to October 2016 were randomized into control group and treatment group（48 each）.Control group was given root planning and subgingival scaling treatment whereas treatment group received the treatment of subgingival minocycline and root planning and subgingival scaling.Comparison was made in CD4+ and CD8+ levels in peripheral blood，the expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood CD4+ T lymphocytes and CD8+ T lymphocytes between two groups and among the mild，moderate and severe patients in treatment group.

Results 3 months after treatment，statistical difference was observed between two groups（P<0.001） with the CD4+ level and CD4+/CD8+ ratios in peripheral blood of treatment group being significantly lower whereas the CD8+ level in peripheral blood of treatment group being significantly higher than those of control group.The CD4+ level and CD4+/CD8+ ratios in peripheral blood of the mild，moderate or severe patients in treatment group decreased significantly，and the CD8+ level was significantly increased，and the difference was statistically significant（P<0.001）.3 months after treatment，the expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood CD4+ and CD8+ T lymphocytes of treatment group were significantly lower than those in control group and there was a statistical difference（P<0.001）.The expression of PD-1 and PD-L1 in peripheral blood CD4+ and CD8+ T lymphocytes of the mild，moderate or severe patients in treatment group decreased significantly，and the difference was statistically significant（P<0.01 or 0.001）.

Conclusion Minocycline adjuvant treatment can significantly reduce the proportion of CD4+ in peripheral blood of patients with chronic periodontitis，improve the proportion of CD8+ and inhibit the expression of PD-1 and PD-L1.

【Key words】 minocycline;chronic periodontitis;T cell subset;programmed death-1;programmed death ligand-1

慢性牙周炎是一种口腔科常见慢性炎症，主要特征为牙周组织破坏，临床表现为牙周附着及牙槽骨逐步丧失，若未能及时给予有效治疗，患者将出现牙齿逐步松动，甚至脱落[1]。研究认为牙周破坏主要与特定微生物感染和相关炎症免疫反应有关，其病理学变化包括形成牙周袋、牙槽骨吸收和活动性牙周病，临床需根据患者具体牙周炎分型及分度确定具体治疗方案[2]。目前，慢性牙周炎患者临床主要治疗方案为机械治疗，如根面平整和龈下刮治等，目的为去除患者牙石和菌斑微生物。研究发现米诺环素对慢性牙周炎有一定疗效，尤其是具有较深牙周袋的患者疗效十分理想，通过在患者牙周袋中放置米诺环素，可获得十分理想的辅助疗效[3]。米诺环素作为四环素类的一种，具有广谱抗菌效果，且具有极强的组织渗透性，能够迅速发挥理想抑菌效果[4]。程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）与程序性死亡分子-1配体（programmed death ligand-1，PD-L1）信号通路，于近年被发现其与肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病以及慢性感染等密切相关[5]。PD-1和PD-L1主要在活化T淋巴细胞的表面进行表达，慢性牙周炎发病过程中可能有PD-1/PD-L1信号通路的参与，PD-1和PD-L1表达量与牙周炎症程度呈正相关[6]。T细胞亚群同慢性牙周炎炎症反应程度具有明显相关性[7]。米诺环素虽然对慢性牙周炎具有明显疗效，但对患者外周血T细胞亚群及PD-1、PD-L1表达是否有影响尚未见报道。本研究主要通过探究米诺环素辅助治疗对慢性牙周患者外周炎血T细胞亚群及PD-1、PD-L1表达的影响，以期为慢性牙周炎患者临床治疗提供一定参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年10月～2016年10月在我院口腔科接受治疗的96例慢性牙周炎患者，根据随机数字表将其分为对照组和治疗组，每组48例。其中治疗组患者细分为轻度、中度和重度三个亚组，根据患者附着丧失（clinical attachment loss，CAL）情况及牙齿缺失数目进行划分[8]，轻度：患者牙齿缺失数目不超过3颗，不具有任何位点CAL超过3 mm，全口牙CAL均值在0.6～1.5 mm;中度：患者牙齿缺失数目不超过5颗，CAL超过3 mm的邻面位点数低于8个，分布在6颗牙或3个区以上，全口牙CAL均值在1.6～2.4 mm;重度：患者牙齿缺失数目不超过14颗，不低于3个区存在邻面位点CAL超过5 mm，全口牙CAL均值在2.5 mm以上。其中輕度患者22例，中度患者16例，重度患者10例。各组患者性别、年龄和病程等一般资料对比，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。见表1。本研究方案已通过本院伦理委员会的批准，所有患者及其家属均详细了解本研究方案，且自愿签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准

（1）纳入标准：①均符合慢性牙周炎相关诊断标准[9];②入组前3个月内无免疫调节剂、非甾体类以及抗生素治疗史的患者;③口腔内具有大于18颗牙齿数，且健康牙齿（无修复体、不良充填体、龋病等）数目不得少于4颗的患者;④牙周探诊深度大于4 mm的患牙数目不低于2颗;⑤根尖X线检查表明牙颈部不具有任何牙体病变;⑥入组前半年内未接受过任何牙周治疗的患者;⑦肝肾功能、心肺功能以及心电图检查均显示正常的患者。（2）排除标准：①伴有智力障碍或具有精神病史的患者;②伴有血液病、糖尿病、自身免疫性疾病等严重系统疾病的患者;③超过10颗牙齿有牙槽骨吸收和牙齿明显松动的重度牙周炎患者;④牙髓炎、急性牙周炎或侵袭性牙周炎患者;⑤不能按照要求戒烟、戒酒的患者;⑥处于妊娠期或哺乳期的妇女;⑦有抗生素过敏史的患者。

1.3 治疗方法

对照组通过龈下刮治及根面平整对患者进行治疗。首先医生需密切观察各患者牙周炎范围和严重程度，以及牙周袋等具体情况;治疗前对患者进行局部麻醉，通过超声波洁牙机（Cavitron Bobcat Pro，购自上海晚成医疗器械有限公司）配合龈下刮治器（豪孚迪 Gracey，购自上海康买医疗科技有限公司）对患者右上象限牙齿给予细致龈下刮治，将牙石和菌斑完全刮除，每颗牙齿至少进行10 min的龈下刮治，并对患牙各个象限给予相同工作[10]。然后对软化牙骨质层进行继续刮除，并给予根面平整。在患者龈下刮治及根面平整操作结束后，需仔细清洗患者牙周袋，最大程度清理干净机械操作残留的牙石碎片、肉芽组织及病原菌[11]。治疗组在对照组治疗的基础上给予盐酸米诺环素软膏（派丽奥，批准文号：注册证号H20100244，生产厂家：SunstarINCJapan）进行辅助治疗。采用与对照组同样的操作方法进行龈下刮治及根面平整，在上述操作完成并进行最大程度清理后，将米诺环素软膏缓慢注入患者牙周袋底部，米诺环素软膏注射过程中，需对注射部位进行调整，边注射边后退，将药物注射于最佳位置[12]，以牙龈边缘可见药物为适。

1.4 观察指标

外周血T淋巴细胞亚群及表面PD-1、PD-L1的表达：采集每位患者治疗前和治疗后3个月时清晨空腹静脉血5 mL，并置于还有肝素钠抗凝的灭菌试管内，详细标注各患者基本信息，于6小时内进行检测。取含有肝素钠抗凝的全血100 μL分别放入三支试管中，各加入抗体10 μL，其中第一支试管内加入PE-PD-1、PE-Cy5-CD4和FITC-CD8;第二支试管内加入PD-L1抗体（PE-PD-L1）、流式细胞抗体藻红蛋白-Cy5-CD4（PE-Cy5-CD4）和异硫氰酸荧光素标记的CD8抗体（FITC-CD8）;第三支试管内加入PE-IgG1、PE-Cy5-IgG1和FITC-IgG1。三支试管均在避光室温条件下孵育半小时，然后加入2 mL细胞裂解液，在红细胞裂解后再加入PBS进行2次离心洗涤，并通过PBS重悬，然后通过流式细胞仪（贝克曼库尔特 FC 500 MCL/MPL，购自贝克曼库尔特商贸有限公司）进行检测[13];CD4+、CD8+水平和CD4+/CD8+比例同样通过流式细胞仪进行测定，采用双色直标免疫荧光法检测，试剂盒均购自武汉博士生物有限公司，具体检测方法操作步骤均严格参照使用说明书进行。

1.5 统计学方法

所有数据均采用SPSS 20.0统计软件分析，以百分数（%）表示计数资料，组间对比分析采用卡方检验进行;计量资料符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析（F检验），进一步两两比较采用LSD检验，两组均数比较采用独立样本t检验，组内前后比较采用配对样本t检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后外周血T细胞亚群变化情况

治疗后3个月，两组患者外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明显降低，CD8+比例均明显升高，与治疗前相比差异均有统计学意义（P<0.001）;此外，治疗组患者治疗后3个月，外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明显低于对照组，CD8+比例均明显高于对照组，两组数据差异有统计学意义（P<0.001）。见表2。

2.2 治疗组中三个亚组患者治疗前后外周血T细胞亚群变化

治疗前，轻度、中度和重度患者随着病情的加重，外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+明显升高，CD8+比例明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。米诺环素辅助治疗后，轻度、中度和重度患者外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明显降低，CD8+比例均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.001）。见表3。

2.3 两组患者治疗前后外周血T淋巴细胞PD-1和PD-L1表达情况

治疗后3个月，两组患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1和PD-L1表达水平均明显降低，与治疗前相比差异均有统计学意义（P<0.001）;此外，治疗组患者治疗后3个月，外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1和PD-L1表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.001）。见表4。

2.4 治疗组中三个亚组患者治疗前后外周血T淋巴细胞PD-1和PD-L1表达

治疗前轻度、中度和重度患者随着病情的加重，外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1和PD-L1表达水平均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;且治疗后，轻度、中度和重度患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1和PD-L1表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.01或0.001）;各亚组患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1和PD-L1表达水平比较有统计学意义（P<0.05）。见表5。

3 讨论

大部分慢性牙周炎患者有牙龈出血症状，炎症进一步加重将导致牙龈肿胀、附着消失及牙齿出现不同程度松动等[14]。龈下刮治與根面平整治疗主要通过机械作用将牙周袋牙石及菌斑去除，其本质为深层清洁牙骨质，两者通常共同进行，为临床轻度或中度牙周炎患者主要治疗措施[15]。

米诺环素具有极强的组织渗透性，可迅速发挥有效抑菌作用，且对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌具有极强抑菌效果，米诺环素还具有牙本质小管开放作用，这有利于受病原菌侵蚀的牙骨质再生[3，16]。米诺环素有可能会引起多方面不良反应，但本研究因采用局部给药，副作用轻微，极少数患者会出现牙龈局部红肿等过敏反应，表现十分轻微，停用后很快自然消退。

CD4+为辅助性T细胞，CD8+为细胞毒性T细胞，CD4+/CD8+比例关系为免疫调控的一个重要枢纽，在慢性牙周炎患者中，其外周血CD4+ T淋巴细胞比例显著升高，而CD8+ T淋巴细胞比例将明显降低[17]。本研究结果表明，治疗组患者治疗后3个月，外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明显低于对照组，CD8+比例均明显高于对照组，米诺环素辅助治疗后，治疗组中，轻度、中度和重度患者外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例以及CD4+/CD8+均明显降低，且CD8+比例均明显升高。可见，米诺环素不仅能够有效抑制慢性牙周炎患者牙周组织炎症反应，对患者免疫功能恢复亦具有一定促进作用。

PD-1是近年来发现的一种重要的负性共刺激信号分子受体，其与配体PD-L1相结合后，能够抑制机体内T细胞增殖，发挥负向调控免疫应答作用，在肿瘤免疫逃逸及慢性感染等的免疫反应介导过程中具有十分重要的作用[17]。近年来，有学者提出，最终造成慢性牙周炎牙周组织破坏的关键因素是机体对病原菌的免疫应答[18]。Th1和Th2平衡对慢性牙周炎发生具有重要影响，而PD-1/PD-L1信号途径可能会对Th1和Th2的平衡产生一定影响，从而抑制免疫反应，导致疾病慢性迁延[19]。研究发现，慢性牙周炎发生过程中OPG/RANKL/RANK信号通路的参与，PD-1/PD-L1可能对上述信号途径产生影响，从而对慢性牙周炎发生发展产生影响[20]。本研究结果发现，治疗组患者治疗后3个月，外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1和PD-L1表达水平均明显低于对照组，提示米诺环素辅助治疗不仅显著降低患者外周血T淋巴细胞亚群中CD4+比例，有效提升CD8+比例，而且可抑制PD-1和PD-L1的表达。

综上所述，米诺环素辅助治疗在慢性牙周炎临床治疗中具有重要价值。但本研究还存在一定局限性，如研究时间过短、研究对象数量较少，未对PD-1、PD-L1在慢性牙周炎患者中的具体调节机制做深入探究等。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-06-20 修回日期：2019-09-24）

（编辑：王琳葵 梁明佩）

作者简介：吴江花，女，主治医师，医学学士，研究方向：牙周炎疾病。E-mail：jun2009525@163.com

[本文引用格式]吴江花，张虹丽，师静蕊，等.米诺环素辅助治疗对慢性牙周炎患者外周血T细胞亚群及PD-1、PD-L1表达的影响[J].右江医学，2019，47（11）：826-832.