冯丽雄,彭 莺,万恒兴

(深圳技师学院 应用生物系，广东 深圳 518116)

2008版欧盟 GMP附件8《原辅包装材料的取样》法规对起始物料规定，起始物料取样需要对每个包装进行单独取样，独立检测鉴别[1]。中国2010版GMP也要求对每一包装内的原辅料进行确认。确认方式包括逐一鉴别或核对确认，用于注射剂的原辅料需要逐一鉴别[2]。国内头孢菌素内的原料厂家(华北制药河北华民药业，齐鲁安替制药有限公司，浙江永宁药业股份有限公司，浙江普洛得邦制药有限公司，深圳信立泰药业股份有限公司，国药集团致君(苏州)制药有限公司，珠海联邦制药股份有限公司，苏州东瑞制药有限公司，丽珠集团丽珠制药厂，广东立国制药有限公司)均装在铝桶内，见图1。鉴别需要对原料进行取样，二次开桶对原料，特别是无菌原料，存在微生物污染的风险。对于非无菌原料，企业通过逐件的核对标签信息，按照企业的制定取样规则进行抽样检验，通过供应商审核等措施，来避免物料的混淆，但还是无法符合欧盟审计要求[3]。

图1 头孢菌素原料铝桶

2015年版中国药典通则收录拉曼光谱法为药典方法[4]，拉曼光谱具有检测时间短、 样品量小，样品无需处理、非接触性、非破坏性等优点，可用于定性和定量检测[5-6]。拉曼光谱在国内外逐渐被广泛使用[7-8]。手持式快速拉曼分析仪具有体积小、质量轻、易于携带，适用于企业车间快速检测[9]。

本文用对照品建立部分头孢菌素原料拉曼光谱图库，通过命中率指数(hit quality index，HQI)对标准图库进行评价，并对鉴别的准确性进行验证，方法运用于生产快速的鉴别，避免头孢菌素类原料二次开桶微生物污染风险。

1 仪器与药品

1.1 仪器

瑞士万通Mira M-1手持式快速拉曼分析仪，激光器(激发波长):785 nm；波长范围: 400 ～ 2300 cm-1；光谱分辨率 12 ～ 14 cm-1(半峰宽) ；检测方式：逐格扫描(orbital raster scan ，ORS)；曝光时间：自动模式；分析软件：snowy range peak。

1.2 药品

头孢唑啉钠(来源：华北制药河北华民药业；齐鲁安替制药有限公司)，头孢地尼(来源：浙江永宁药业股份有限公司；浙江普洛得邦制药有限公司)，头孢克肟(来源：浙江普洛得邦制药有限公司；齐鲁安替制药有限公司)，头孢西丁钠(来源：深圳信立泰药业股份有限公司；国药集团致君(苏州)制药有限公司；华北制药河北华民药业)，头孢噻肟钠(来源：华北制药河北华民药业；珠海联邦制药股份有限公司；苏州东瑞制药有限公司)，头孢曲松钠(来源：丽珠集团丽珠制药厂；齐鲁安替制药有限公司)，头孢呋辛酯(来源：广东立国制药有限公司；珠海联邦制药股份有限公司)，头孢呋辛钠(来源：国药集团致君(苏州)制药有限公司；广东立国制药有限公司；深圳信立泰药业股份有限公司)；对照品来源(国药致君(深圳)制药有限公司中心化验室)。

2 方法与结果

2.1 对照拉曼光谱图库建立

拉曼光谱图库中每个光谱代表一种原料。本文用选定研究对象的对照品来建立拉曼光谱图库。对照品装在硼硅玻璃管制注射剂瓶中，选用短聚焦镜头(焦点聚镜头0.85 mm)扫描注射剂瓶底部位置，每个对照扫描6次，同个品种扫描的拉曼光谱通过软件进行平均，作为对照拉曼光谱图库，见图2所示。拉曼光谱相似性常用相似性函数、距离测度和峰匹配进行评价[10]。本文采用命中率指数相似性函数对光谱图库中两个光谱进行初步评估。HQI在0和1之间，HQI越接近1，两个光谱的相似程度越高。计算图谱库中任意两个图谱的HQI，设置HQI阈值为0.95，若HQI高于0.95，两个拉曼光谱相似度高[11]。图谱库中若有两个或两个以上的图谱的HQI高于0.95，产品存在错误鉴别的风险，须进行可行性评估。对照图库HQI矩阵结果见表1。HQI矩阵结果显示，不同品种的之间的HQI均小于0.90。头孢呋辛酯是头孢呋辛的衍生物[12]，结构相似，相互的HQI为0.84和0.86。

表1 标准图谱库命中率指数

A头孢唑啉钠； B头孢地尼；C头孢克肟；D头孢西丁钠；E头孢噻肟钠；F头孢曲松钠；G头孢呋辛酯；H头孢呋辛钠

图 2 对照品拉曼图谱

Fig.2 References Raman spectra

2.2 拉曼光谱图库验证

采用概率测试(F-检测)，用主成分分析对建立的图库进行验证。 在验证图库中采用测试临界数p值评估，判断测试样品是否与拉曼光谱图库中的对照图谱一致。对于鉴定“通过”，p值必须高于(1-阈值)，对于 鉴定“失败”，p值低于(1- 阈值)。在本实验的验证过程中，选择阈值0.95。随机抽取样品来评估评估图库专属性，所有待鉴定的样本按照图库建立的操作程序进行测试。拉曼光谱图库验证满足两个条件：1)如果使用正确的样品来测试光谱图库，则“通过”(真阳性)；2)如果使用不正确的样品来测试光谱图库，则“失败”(真阴性)，见图3。验证不同的供应商的原料各选择20批样品进行测试。420批样品验证HQI矩阵结果见表2。阳性样品HQI均大于0.98，阴性样品的HQI均小于0.90。420批样品验证鉴定正确率100%。

图3 拉曼图库验证条件

表2 验证测试矩阵结果

Table 2 Matrix for validation results

注:P表示鉴定“通过”；F表示鉴定“失败”

3 讨论

在建立拉曼光谱标准图库时，为了提高鉴别的正确率，装对照品容器的材质需和车间取样鉴别的材质一致，用不同材质的两种容器(透明的塑料取样袋和低硼硅玻璃管制注射剂瓶)进行测试,HQI值降低0.01。

在样品验证矩阵结果中，对角线(表2 绿色部分)的HQI值应为1.00(或非常接近1.00，若HQI在0.97～0.99之间，在实验误差范围内是可以接受的)。非对角线样品HQI大于 0.85，鉴别有潜在混淆的风险；HQI在0.85和0.95之间表示混淆的风险是轻微的；若HQI大于0.95，存在重大混淆的风险，需进一步评估鉴别的可行性。企业可以根据验证的数据，通过风险评估确定合适的命中率指数作为鉴别合格放行标准。

建立的鉴别方法应结合企业实际的取样规程，确保车间取样操作流程符合企业文件要求，避免审计缺陷。

4 结论

本试验建立了手持式拉曼快速鉴别部分头孢菌素类原料方法，用命中率指数对拉曼光谱图库进行评估和验证，结果表明该方法简便、准确，可以用于头孢菌素类企业生产的快速鉴别。