阎春兰，唐豪，陈荣清，刘虹杉，吴丽娜

(中南民族大学 生命科学学院 微生物资源与利用湖北省工程技术研究中心， 武汉 430074)

人类发现抗生素并对其大规模生产使用是人类医学史上的伟大进步，自抗生素投入使用至今挽救了数以亿计的生命.在20世纪第一代青霉素投入使用的同时，就出现了对青霉素具有抗性的细菌.事实上，耐药性的产生是微生物自然进化的结果，然而抗生素的大量使用、滥用，导致这一进程大大加快[1].一种新的抗生素从临床到使用需要5～10年，而细菌对其产生耐药性仅需2年[2]. 胡付品等[3]对国内主要地区30所教学医院临床分离的153059株细菌进行抗菌药物敏感性试验，结果显示检测细菌中除革兰氏阳性菌对万古霉素、革兰氏阴性菌对碳青霉烯类抗菌药物比较敏感外，其余细菌均对现有抗生素具有不同程度的耐药性，并且临床分离菌对常用抗菌药物的耐药性仍呈增长趋势.针对目前日益严重的环境微生物和致病菌的耐药性问题，目前有以下策略应对：加强药政管理，合理使用抗生素，建立细菌耐药监测网，加强实验室内质控，开发新治疗方法，寻找新型的抗耐药菌抗生素等[4-6].

本项目以从实验室保存的金黄色葡萄球菌平板上发现的一株对其有较强抑制作用的菌株YZ-02为研究材料，对YZ-02的形态特征、生长特性、耐药性、抑菌性等进行研究，并利用16S rRNA基因序列对其进行分子鉴定，测定其基因组框架图，探究其可能的抑菌机制，为该菌株的开发利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验样品来源于实验室保存的金黄色葡萄球菌平板上发现的一株对其有较强抑制作用的菌株YZ-02.常见菌株包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、嗜线虫沙雷氏菌、产气肠杆菌、大肠杆菌等均为本实验室保存；各菌株用牛肉膏蛋白胨培养基于37 ℃培养.碳源或氮源实验采用MSM基本培养基[7].Taq聚合酶(Takara)；PCR产物及DNA凝胶回收试剂盒(博大泰克)； 16S rDNA的基因测序和表1中引物合成(天一辉远)；反转录所用试剂为PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)，FastStart Universal SYBR Green Master (Rox). PCR仪 (T-personal 48，Biometra)；荧光定量PCR仪(Applid Biosystems).

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of the PCR primers

1.2 YZ-02菌株的分离纯化与鉴定

从实验室平板上挑取YZ-02菌株，再在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上进行划线分离纯化3～4次，进行革兰氏染色后在光学显微镜下镜检，检测是否纯化完全，以及观察菌体形态特征.

提取菌株YZ-02的基因组DNA[8]为PCR模板，采用通用引物16S-F/16S-R进行16S rDNA扩增.PCR扩增条件参考文献[9].PCR产物回收后送测序，获得该菌株的16S rDNA序列后，选取GenBank数据库中代表性菌株的16S rDNA 序列，利用Blast软件与该菌株的16S rDNA序列进行比较分析，构建系统进化树.采用Mega 5.0程序对系统进化树进行分析.

1.3 YZ-02菌株的生长实验

采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，菌种接种量为5%，在37 ℃，200 r/min下分别培养0,2,4,8,12,16,20,24 h，在分光光度计中测量OD600值，绘制以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标的生长曲线.

1.4 YZ-02菌株的碳源与氮源利用实验

采用MSM基本培养基，菌种接种量为5%，探究碳源实验时，以0.1%氯化铵为氮源，分别以葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、淀粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氢钠作为碳源，加入量为0.5%；探究氮源实验时，以0.5%葡萄糖为碳源，分别以蛋白胨、亚硝酸钠、酵母提取物、硝酸钾、氯化铵作为氮源，加入量为0.1%，在37 ℃，200 r/min下培养0,24,48,72 h，在分光光度计中测量OD600值[7,10].

1.5 YZ-02菌株的生理生化特性

1.5.1 IMViC试验

采用大肠杆菌IMViC生化鉴定试剂盒鉴定菌株的生化特征，其中包括吲哚试验、甲基红试验、伏普试验和柠檬酸盐试验.

1.5.2 淀粉水解试验

将YZ-02菌株划线接种于淀粉培养基上，37 ℃温箱培养24 h，观察菌种生长情况，在平板上滴加碘液，观察是否出现无色透明圈.

1.5.3油脂水解试验

将YZ-02菌株划线接种于油脂培养基上，37 ℃温箱培养24 h，观察菌苔颜色.

1.5.4 尿素试验

将YZ-02菌株划线接种于尿素培养基上，35 ℃温箱培养48 h，观察培养基颜色变化.

1.5.5 硫化氢试验

将YZ-02菌株在醋酸铅试管培养基中做穿刺培养，37 ℃温箱培养48 h，观察培养基颜色变化.

1.6 YZ-02菌株的抑菌性实验

采用牛津杯法[11]测定YZ-02菌株对常见菌株的抑制作用，常见菌株包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、嗜线虫沙雷氏菌、产气肠杆菌、大肠杆菌.

1.7 YZ-02菌株的耐药性实验

在牛肉膏蛋白胨培养基中加入相应抗生素制成抗生素平板，采用的抗生素为四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、庆大霉素和壮观霉素等，将YZ-02菌株划线接种到抗生素平板上，37 ℃培养48 h后观察其生长情况.

1.8 YZ-02抑菌机制初步探究

将YZ-02菌株大量接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37 ℃，200 r/min培养过夜，冷冻离心收集菌体，测定完成YZ-02菌株的全基因组框架图.分析框架图结果和查阅文献，合成引物，对YZ-02菌株中可能产生的细菌素基因进行PCR验证，回收扩增成功的基因并测序，与Genbank中序列进行比对.抗生素基因引物[12,13]如表1所示.

加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌诱导后的YZ-02菌株，采用Trizol法提取菌株总RNA，再用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒将RNA反转录成cDNA，以YZ-02菌株为对照，对菌株中的扩增成功的细菌素基因进行荧光定量PCR分析.qRT-PCR引物见表1，以16S rDNA基因为内参.

2 结果与分析

2.1 YZ-02菌株的分离鉴定

YZ-02菌落分布密集，菌落较大，不透明，菌落表面形成褶皱，不易挑起；YZ-02菌体为杆菌，形成芽孢，菌体长0.3～0.7 μm，宽0.1～0.15 μm，芽孢长约0.5 μm，宽约0.1 μm；革兰氏染色结果为阳性.

将YZ-02菌株的16S rDNA序列与GenBank中的序列进行比对，发现该菌株与Bacillus属中的多株细菌的相似性均在99%以上；选取同源性高的菌株用于系统发育树的构建，结果如图1所示.由图1可见：YZ-02菌与Bacillus属的多种菌株，如B.methylotrophicusL07，B.vallismortis263XY1，B.velezensisYK50，B.amyloliquefaciensRx-35，B.subtilisATCC19217，均聚在一起，细菌序列高度吻合，因此可以鉴定YZ-02细菌为芽孢杆菌属细菌 (Bacillus).

图1 YZ-02菌株基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.1 Phylogenetic analysis of the strain YZ-02 based on 16S rDNA sequence

2.2 YZ-02菌株的生长及生理生化特征

以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制了YZ-02在牛肉膏蛋白胨培养基中的生长曲线，如图2a所示.从图2a中可见：0～2 h为菌株生长的延滞期，2～12 h为菌株生长的指数期，菌株在此期间生长迅速，12 h后生长呈下降趋势.

YZ-02菌株的碳源利用实验如图2b所示，YZ-02 菌株除不能利用碳酸氢钠之外，对于麦芽糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、葡萄糖、酵母提取物、牛肉膏和蛋白胨均可利用，其中对淀粉利用效果最佳；在氮源利用实验(见图2c)中，YZ-02 菌株不能利用酵母提取物，但可利用蛋白胨、亚硝酸钠、硝酸钾和氯化铵作为氮源，且利用效果差不多.

a) YZ-02菌株的生长曲线；b) YZ-02菌株碳源利用实验结果；c) YZ-02菌株氮源利用实验结果图2 YZ-02菌株的生长曲线和碳源与氮源利用实验结果Fig.2 Growth curve,carbon sources and nitrogen sources utilization of strain YZ-02

YZ-02菌株的生理生化特征结果如表2所示.

表2 YZ-02菌的生理生化实验结果Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of YZ-02

注：“+”为阳性，“-”为阴性

在IMViC试验中，吲哚试验结果为阴性，说明该菌株不具有色氨酸酶，不能利用色氨酸；甲基红试验和伏普试验结果为阴性，说明该菌株在利用葡萄糖的过程中既不能进行混合酸发酵也不能进行丁二醇发酵；柠檬酸盐的结果显示该菌株不能利用柠檬酸盐.在大分子水解试验中，淀粉水解和油脂水解试验结果为阳性，说明YZ-02菌株可利用淀粉和油脂，而尿素和硫化氢试验结果为阴性，说明该菌株不能产生尿素酶，也不能利用含硫化合物产生硫化氢.

2.3 抑菌性实验和耐药性结果分析

YZ-02对常见细菌的抑制作用结果见表3.由表3可知：YZ-02菌株对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、嗜线虫沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均能产生抑菌圈，且产生的抑菌圈的大小基本相同，在产气肠杆菌平板上牛津杯周围无抑菌圈产生，说明YZ-02菌株能够抑制除产气肠杆菌之外的几种常见细菌的生长.

表3 YZ-02对常见细菌的抑制作用Tab.3 Inhibition of strain YZ-02 on the common bacteria

注：“-”表示无抑菌圈

YZ-02的耐药性检测结果见表4.由表4可知，YZ-02菌株对不同抗生素的耐药性不同.YZ-02菌株在壮观霉素(Sp10)、卡那霉素(Km20)、链霉素(St50)、庆大霉素(Gm5)平板上不能生长，说明该菌株对这4种抗生素不具有耐药性；YZ-02菌株在氨苄青霉素(Ap20)平板上生长，但生长较差，说明该菌株对氨苄青霉素具有一定的耐药性；YZ-02菌株在四环素(Tc2)和氯霉素(Cm2)平板上长势良好，说明YZ-02菌株对这两种抗生素具有较强的耐药性.

表4 YZ-02的耐药性检测结果Tab.4 Antibiotic resistance of strain YZ-02

注：“-”表示没有生长，“+”表示长势较弱，“+++”表示长势良好

2.4 YZ-02菌株抑菌机制的初步探究

YZ-02菌株全基因组大小约为3.89 Mbp，GC含量为46.58%，共有3899个ORF，利用不同的数据库，对YZ-02基因组中所有蛋白编码基因进行了功能注释，发现基因组中含有多个细菌素基因的相似序列，如mycosubtilin (contig1_968)、surfactin (contig5_3268)、flagellin (contig2_1468)、TasA (contig2_1469)、lantibiotic (contig2_1305) 等.

结合基因组框架图结果和文献，合成6对引物 (见表1) 进行PCR扩增，发现YZ-02中可扩增获得tasA基因、hag基因和ituA基因 (图3).

M) DL2000 marker; 1)masA基因; 2) tasA基因; 3) hag基因; 4) spaS基因; 5) ituA基因; 6) sfp基因a)针对抗生素基因进行PCR验证；b)PCR产物回收图3 YZ-02菌株中抗生素基因PCR验证和回收Fig.3 PCR confirmation and recovery of bacteriocin genes in strain YZ-02

将YZ-02中的tasA基因、hag基因和ituA基因测序后，与Genbank中的tasA基因 (JF791687.1)、hag基因 (AB033501.1)、ituA基因 (D21876.1) 分别进行比对发现，分别具有98%、95%、98%的相似性.

用荧光定量RT-PCR分析hag基因和ituA基因在YZ-02菌株中的表达量，结果如图4所示.如图4可见：在加入大肠杆菌诱导后，hag基因和ituA基因的表达量均为对照的4.14±0.35倍和10.27±0.76倍；在加入金黄色葡萄球菌诱导后，hag基因和ituA基因的表达量均为对照的2.45±0.23倍和2.67±0.43倍.统计分析表明，hag基因和ituA基因的表达达到显著差异(P<0.05)，表明hag基因和ituA基因的表达在大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的诱导下表达增加.

C：对照；Ec：大肠杆菌；Sa：金黄色葡萄球菌图4 hag基因和ituA基因的RT-PCR结果 Fig.4 RT-PCR result of hag gene and ituA gene

3 讨论

全球细菌耐药性问题日益严重，应对这一危机需要多管齐下，其中，不断地对新型的抗耐药菌抗生素的研发是救治感染患者的主要手段和方法[5]，尤其是研究开发一些新结构类别抗生素和(半)合成抗生素，以及非抗生素疗法，如CRISPR-Cas9等的应用[6]、噬菌体及噬菌体裂解酶疗法[14]等.研究表明：细菌产生的细菌素，与其他的细菌素、抗生素、噬菌体裂解酶或抗微生物药物结合，可以用于防治病原菌[15].

作为一种广泛存在于自然界的非致病细菌，芽孢杆菌可产生多种抗菌素，包括磷酯类抗生素，肽类抗生素，聚酮化合物，脂肽类抗生素等，具有抗菌谱广、物理化学性质稳定等特点，既可直接作用于其它病原菌的核酸、蛋白质、细胞膜、细胞壁等，也可干扰其生物合成系统，能够克服病原菌对现有抗生素的耐药性问题[16,17]，具有十分诱人的应用前景和不可低估的开发潜力，尤其是生物工程利用价值极高的肽类和脂肽类抗生素.Subtilin是芽孢杆菌菌株中最早发现的抗菌肽(肽类抗生素)之一，是一种硫醚抗生素，能够通过核糖体合成途径进行合成，其结构与广泛应用的乳链菌素(nisin)类似[18]，其前体肽链由SpaS基因编码[19]；Iturin是一类可以强烈抑制病原体生长的脂肽，通过非核糖体途径合成，该家族成员都具有环状结构，并且由7个氨基酸和1个β-氨基脂肪酸组成[20]；由TasA基因编码的31 kDa的孢子形成蛋白，在环境中具有广谱抗菌活性，赋予孢子竞争优势[21].Asano等[22]克隆了hag基因，其表达产物是鞭毛蛋白flagellin，也具有抑菌活性，鞭毛蛋白flagellin的抑菌活性可以解释多种芽孢杆菌的抑菌作用.

本文从金黄色葡萄球菌平板上发现的这一株有较强抑制作用的芽孢杆菌属细菌，可抑制多种常见细菌如金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、嗜线虫沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌等的生长，抑菌性较强；同时，该菌对现有的抗生素的耐药性不强；对其基因组框架图进行分析发现基因组中存在多种芽孢杆菌特有的细菌素基因如mycosubtilin、surfactin、flagellin、TasA、lantibiotic 等，通过PCR验证获得tasA基因、hag基因和ituA基因，与Genbank中的tasA基因 (JF791687.1)、hag基因 (AB033501.1)、ituA基因 (D21876.1) 分别进行比对发现，分别具有98%、95%、98%的相似性，RT-PCR的结果显示在大肠杆菌或金黄色葡萄球菌诱导后hag基因和ituA基因的表达量增加，YZ-02菌株对多个常见细菌的抑菌作用可能是这些细菌素单个或联合作用的结果.本研究结果为后续进一步开发利用该菌株奠定了基础.