徐丽华，兰胜芝，李军星，余斌，张鹏超，李宝臣，袁秀芳*

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江诗华诺倍威生物技术有限公司，浙江 杭州 310018)

支原体(mycoplasma)是一种介于病毒和细菌之间的多形性微生物，广泛存在于人体、畜禽、昆虫、植物及土壤污水等自然界中[1]，能引起人、动物和植物的多种疾病，且大都具有传染性[2-3]。在养猪业中，现已证实的支原体有猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪腹支原体、猪喉支原体、猪絮状支原体等[3]。猪肺炎支原体能引起猪的一种低死亡率、高发病率的慢性呼吸道传染病，患病猪只生长缓慢，饲料利用率低下[3-4]；猪鼻支原体定植于仔猪呼吸道表面，能引起猪的多发性浆膜炎、中耳炎和关节炎；猪滑液支原体感染关节和扁桃体，引起猪的软骨病和关节炎[5]。这3种支原体或与其他呼吸系统疾病混合感染，导致猪死亡率升高，给养猪业带来严重的经济损失。近年来，浙江省生猪存栏量增加，饲养密度高，猪病特别是呼吸道疾病发生率居高不下。本实验室对2014—2018年浙江省内送检的临床疑似病猪进行3种猪支原体的流行病学调查，旨在了解浙江省3种支原体的流行状况，为制定有效的防治措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体阳性样品由本实验室分离鉴定保存。临床案例为2014—2018年采集自浙江省不同规模猪场，具有关节肿胀、肺小叶实变、心包积液等临床疑似支原体病变猪只。

1.2 试剂和仪器

病毒DNA提取试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司(L0t0507)，Taq DNA聚合酶、1 000 bp DNA Marker、dNTPs等购自上海生工生物工程技术服务有限公司，无水乙醇等化学试剂均为国产分析纯。

1.3 引物合成

参考Stakenborg等[6]公布的引物序列，委托上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.4 DNA模板制备

从-70 ℃取出临床病料0.1 g，置于Eppendorf管中，加入pH 7.0 PBS缓冲液0.5 mL，匀浆机碾磨成匀浆，离心取上清0.1 mL。按照病毒DNA提取试剂盒说明书操作，提取DNA模板于-20 ℃保存。

1.5 PCR扩增

用提取的3种支原体DNA作为模板，分别扩增3种支原体基因片段。反应体系分别为25 μL，在PCR反应管中分别加入10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mM dNTPs 2.0 μL、上、下游引物各1.25 μL、DNA模板2.5 μL、Taq酶0.2 μL、双蒸水15.3 μL。扩增条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应完成后，取5 μL PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，用BIO-RAD成像系统观察拍照。

2 结果与分析

2014—2018年，浙江省不同县市的养猪场采集临床疑似病料238份，分别进行猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体扩增，扩增片段分别为1 000、1 129、754 bp。

结果(图1)显示，临床疑似样品中猪肺炎支原体检测阳性数为45份，阳性率18.9%；猪鼻支原体阳性数为105份，阳性率为44.1%；猪滑液支原体阳性数为0。

M—1 000 bp DNA Marker；1—临床样品；2—阴性对照；3—阳性对照。A—猪肺炎支原体；B—猪鼻支原体；C—猪滑液支原体。图1 3种支原体的PCR扩增结果

在不同年份检测3种猪支原体病原，其中2014—2018年分别检测58、74、45、38、23份。2014—2018年猪肺炎支原体阳性率分别为12.1%、20.3%、20.0%、34.2%、4.3%；猪鼻支原体阳性率分别为51.8%、47.3%、40%、42.1%、26.1%；猪滑液支原体阳性率均为0。2014—2018年，猪肺炎支原体和猪鼻支原体发生混合感染24份，分别为5、10、5、4和0份，两者混合感染比例为10.08%。

3 讨论

猪肺炎支原体、猪鼻支原体和猪滑液支原体能引起患病猪关节肿大，心包积液，咳嗽、气喘等呼吸道症状，已经成为猪场的常见病和慢性多发病，因其常发生混合感染和继发感染，已严重危害养猪业的发展。目前检测支原体的方法主要有分离培养、血清学法和PCR方法等。猪支原体分离培养条件苛刻，且生长速度缓慢，需要1周甚至更长时间才能观察其形态，也容易造成实验环境污染。血清学方法可检测猪肺炎支原体和猪滑液支原体的抗体水平，不能直接反映病原感染情况。本试验采用PCR方法，从疑似病料中分别检测3种支原体的感染情况，给养殖场确诊疫病提供了快速准确的方法。

调查发现，猪滑液支原体检出率为0，说明该病原近几年在浙江省地区没有流行。猪肺炎支原体、猪鼻支原体检出率分别为18.9%、44.1%，猪鼻支原体感染率明显高于猪肺炎支原体，与Joyce等[7]对江苏省猪肺炎支原体和猪鼻支原体感染的调查结果符合。实际生产中，大部分猪场均会接种猪肺炎支原体疫苗，尚无猪鼻支原体疫苗，且一般抗菌药物对猪鼻支原体治疗效果不佳，导致猪场猪鼻支原体发病率高于猪肺炎支原体。同时，猪鼻支原体可能污染PK-15等细胞，导致猪瘟疫苗、猪蓝耳病疫苗等细胞苗污染，在猪场免疫接种时同时接种了猪鼻支原体。研究发现，猪肺炎支原体和猪鼻支原体混合感染病例24份，混合感染比例10.08%，说明猪场发病猪存在两者混合感染的现象。2018年8月，由于猪场疫病暴发，各地猪场严进严出，临床病料减少，猪支原体检出率下降。2014—2017年，猪肺炎支原体检出率有逐年上升趋势，猪鼻支原体每年略有下降。分析原因，近几年临床上大量使用支原净等抗生素，导致猪肺炎支原体耐药性越来越严重，猪肺炎支原体发病率有所反弹[8]。另外，2014年猪常见疫苗中猪鼻支原体污染严重，疫苗免疫时人为接种猪群可能性大，随着猪场及经销商对猪鼻支原体污染细胞培养物问题的重视，近几年猪鼻支原体污染逐渐减少。