贺国强，赵冬雪，李恒全，李松梅，魏秀梅，蔡兴宏，敖红*

(1.牡丹江烟草科学研究所，黑龙江 哈尔滨 150076； 2.东北林业大学 生命学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.牡丹江烟叶公司 东宁分公司，黑龙江 东宁 157299； 4.哈尔滨烟叶公司 宾县分公司，黑龙江 宾县 150400；5.牡丹江烟叶公司，黑龙江 牡丹江 150711)

套作作为一种新型农业栽培模式，在调整农业产业结构、提高经济效益等方面的作用已得到广泛认可[1]。套作可争取时间提高光能和土地利用率，有利于后作的适时播种和栽植，而且能有效提高农田生态系统的生物多样性[2]。目前，农业套作的研究重点已逐渐由地上部分的相互作用向地下部分的相互作用转移，尤其是套作物种根系间和根际微生物间的相互作用[3-4]。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成成分，土壤的物质和能量循环转化均在不同微生物的作用下完成[5-7]。微生物群落结构与微生物群落多样性对土壤可持续利用有重要作用，可作为指示土壤质量和评价土壤肥力的重要指标[8]。目前，关于植烟土壤微生物方面的研究多集中在酶活性、微生物量碳、土壤细菌数量等方面[9-10]，关于植烟土壤微生物群落功能的研究较少。土壤微生物群落功能多样性的研究方法有很多，其中，Biolog微孔板是能够较敏感地反映微生物群落功能的一种鉴定方法，它通过对单一碳源的利用测定反映微生物群体水平的情况，以此来表征微生物群落功能多样性。本研究采用Biolog微孔板技术对牡丹江市烟草科学研究所试验田套作紫花苜蓿或小麦的烟草团棵期、成熟期的土壤微生物碳代谢能力进行研究，旨在揭示烟草套作对植烟土壤微生物多样性的影响，为烟草套作模式开发提供一定的参考和依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地设在牡丹江市烟草科学研究所试验田。试验田地处寒带东部，128°02′～131°18′E、43°24′～45°59′N。全年日照时数约2 400 h，年平均气温6.1 ℃，年均无霜期140 d，年均降水量580 mm。供试土壤为暗棕土。试验地块土壤肥力均匀一致，土壤质地为黏壤，土壤类型为河淤土，土壤pH为7.2，碳、氮、硫含量分别为13.7、2.6、0.7 g·kg-1，有机质含量为23.1 g·kg-1，水解性氮含量为89.55 mg·kg-1，有效磷含量为21.59 mg·kg-1，速效钾含量为165.45 mg·kg-1。

1.2 处理设计

供试烟草品种为龙江911，与小麦(TriticumaestivumL.)或紫花苜蓿(MedicagosativaL.)套作。上述试验材料均由黑龙江省牡丹江市烟草科学研究所提供。

于2016年开展定位试验，共3个处理：处理1，烤烟与紫花苜蓿套作；处理2，烤烟与小麦套作；处理3，不套作对照(CK)。随机区组设计，每处理重复3次，行长6 m、垄距1.1 m，每小区面积59.4 m2。烤烟5月移栽，小麦、紫花苜蓿7月下旬播种。烤烟采收结束后，清理烟秆。2016年11月初翻耕小麦秸秆和紫花苜蓿，2017年4月起垄，5月再次移栽烤烟。

1.3 土壤样品采集

于 2017年6月(团棵期)、10月(成熟期)按5点取样法选取植株，去掉表层土壤，用铁铲垂直向下挖取0～20 cm土壤。剔除土壤样品中的杂物，装人无菌的封口袋密封，置于冰盒内带回实验室。土壤样品研磨过筛，放入4 ℃冰箱，用于Biolog-Eco微平板和土壤微生物量碳、氮的测定。

1.4 研究方法

用包含31种碳源的Biolog-Eco微平板对植烟土壤进行微生物群落功能多样性分析。将土壤样品在25 ℃下活化24 h，称取相当于10 g烘干土重的鲜土加入90 mL灭菌NaCl溶液中，加无菌封口膜封口。将样品在涡旋振荡器上振荡1 min，然后置于冰水浴中1 min，反复3次；静置2 min后稀释，逐渐稀释为10-2和10-3的悬浮液。用移液器向微平板上每孔中加人150 μL的10-3的土壤悬浮液，然后，将微孔板置于25 ℃培养箱内连续培养，分别在0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264 h用酶标仪(sunrise remote，TECAN)测定590 nm处吸光值。

称取3份相当于10.0 g干土的鲜土分别放入25 mL小烧杯中。将盛有鲜土的烧杯置于真空干燥器中，并放置盛有无水乙醇氯仿(约2/3体积)的15 mL烧杯2只，烧杯内放入防暴沸玻璃珠。同时，放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，用于吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5 min。关闭真空干燥器阀门，于25 ℃黑暗条件下培养24 h。熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门，取出盛有氯仿和稀NaOH溶液的小烧杯，反复抽真空5次，每次3 min，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中作为不熏蒸对照处理。从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移至80 mL聚乙烯离心管中，加入40 mL 0.5 mol·L-1硫酸钾溶液，300 r·min-1振荡30 min，用滤器过滤。使用multi N/C 2100s TOC分析仪(Analytik Jena，德国)测定土壤微生物量碳、氮。

1.5 数据处理

计算平均颜色变化率(AWCD)，该指标能够表示微生物的代谢强度和对单一碳源的利用能力：

式中：RAWCD为计算得到的AWCD值；Fi为所测定的第i个碳源孔的光密度值，R为对照孔的光密度值，(Fi-R)为负值时则归0。采用Biolog微平板培养96 h的数据进行统计，此时，大部分微生物均已参与碳源的代谢过程，因此，能较全面地描述微生物群落轮廓。

采用Shannon指数(H)、Simpson指数(D)和Mclntosh指数(U)来描述土壤微生物群落代谢的功能多样性：

H=-∑[Ki×ln(Ki)]；

D=1-∑Ki2；

式中，Ki为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率，ni是第i孔的相对吸光值。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳、氮的差值和转换系数(KEC)，从而计算土壤微生物生物量碳、氮。

使用Excel 2003进行数据整理，采用SPSS 19.0进行单因素方差分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物利用碳源的动力学特征

AWCD可以反映土壤微生物群落对碳源的利用程度，表征土壤中微生物的代谢活性。如图1所示，随着培养时间延长，土壤微生物群落对碳源的利用总量先逐渐增长后渐趋平缓。在0～96 h，各处理的AWCD快速增长，说明土壤微生物对碳源的代谢活性极强，且各处理团棵期的AWCD值显著高于成熟期。在96～192 h，AWCD缓慢增加至趋于稳定。其中，团棵期、成熟期均以处理1的AWCD值较高，在整个培养过程中土壤微生物碳代谢活性最强，而CK处理的显著低于2个套作处理，说明套作增强了土壤微生物群落对碳源代谢的能力。

Ⅰ—处理1-团棵期；Ⅱ—处理2-团棵期；Ⅲ—处理3-团棵期；Ⅳ—处理1-成熟期；Ⅴ—处理2-成熟期；Ⅵ—处理3-成熟期。图2～3同。图1 土壤微生物群落随着培养时间的变化

2.2 土壤微生物群落多样性分析

根据培养96 h获得的微生物AWCD值，计算Shannon指数(H)、Simpson指数(D)和Mclntosh指数(U)(表1)。结果显示，不同处理在各项土壤微生物群落多样性指数上存在显著差异。两个套作处理的土壤微生物培养96 h的AWCD值在团棵期和成熟期均显著高于对照，说明套作土壤的微生物代谢活性更强。Shannon指数表示土壤中微生物群落的物种丰富度，其值越高，说明土壤微生物种类越多。团棵期，处理1和处理2的Shannon指数差异不显著，但均显著高于对照；成熟期，处理1的Shannon指数显著高于处理2，且两者均显著高于对照，说明套作能显著提高土壤微生物的群落丰富度，且以套作紫花苜蓿的效果更好。Simpson指数表示常见物种的优势度，Mclntosh指数表示土壤微生物群落物种的均匀度。套作处理的土壤微生物Simpson指数和Mclntosh指数显著高于对照。

表1 培养96 h的土壤微生物群落AWCD和多样性指数

注：同列数据后无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.3 土壤微生物对6大类碳源的利用强度

Biolog-Eco微平板上31种碳源分属于氨/胺类、氨基酸类、羧酸类、其他化合物类、聚合物类和糖类。不同处理各时期土壤微生物群落对不同碳源的利用程度如图2所示。可以看出，不同处理不同生长时期土壤微生物对氨基酸类、羧酸类和糖类的利用程度高于氨/胺类、其他化合物类和聚合物类。团棵期土壤微生物对氨基酸类、羧酸类、其他化合物类和糖类的利用程度显著高于成熟期。成熟期对照处理土壤微生物群落对其他化合物类和糖类的利用程度最低，且显著低于其他处理对其他化合物类和糖类的利用程度。

相同碳源柱上无相同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。图2 不同处理土壤微生物对不同碳源的利用水平

2.4 土壤微生物对碳源利用多样性的主成分分析

主成分分析方法是将不同样本的多元变量重新组合成一组新的互相无关的综合变量，并尽可能多地反映原来变量信息的统计方法。在空间中，点的位置可以直观地反映不同处理的土壤微生物群落的代谢特征，并解释微生物对碳源利用的多样性。从表2可以看出，应用主成分分析方法在31种碳源中提取了3个主成分因子(PC1～PC3)，分别可以解释变量方差的46.5%、15.2%、10.2%，主成分1、2、3的累计贡献率达72.0%，能解释变量的绝大部分信息。

表2 主成分的贡献率和累计贡献率

由图3可知：在PC1轴上，团棵期各处理主要分布在正方向上，处理1的得分系数为8.69～8.23，处理2的得分系数为7.89～8.08，对照的得分系数为3.26～4.12；成熟期各处理主要分布在负方向上，得分系数集中在-2.38～-1.11。在PC2轴上，团棵期，处理1位于正方向上，其他处理均位于负方向上，得分系数分别为-5.02～-2.50和-1.27～-0.45；成熟期，各处理集中分布在PC2轴原点附近。不同生长时期和不同处理在PC轴上呈现出不同的空间分布，说明不同生长时期和不同套作模式下土壤微生物对碳源的利用种类和程度存在明显差异。

图3 不同处理土壤微生物群落利用碳源的主成分分析结果

初始载荷因子反映主成分与碳源利用的关系，载荷因子高表示该碳源对主成分的影响较大。从表3可以看出，载荷因子大于0.85、表现出与主成分1显著相关的碳源包括：糖类2种、其他化合物类2种、羧酸类1种、氨基酸类1种，与主成分2显著相关的碳源仅羧酸类1种。由此可知，糖类、其他化合物类和羧酸类碳源是引起土壤微生物群落代谢差异的主要碳源类型。

表3 31种碳源的主成分载荷因子

2.5 不同处理对土壤微生物量碳、氮的影响

土壤微生物量碳、氮是土壤碳素和氮素养分转化和循环研究中的重要参数，能直观地反映土壤微生物和土壤肥力水平，在土壤肥力和植物营养供应中具有重要作用。从表4可以看出，在团棵期和成熟期，2个套作处理的土壤微生物量碳、氮含量均高于对照。

表4 不同处理对土壤微生物量碳、氮含量的影响

3 讨论

本研究中，不同生长时期、不同套作模式的土壤微生物对碳源总量的利用呈现出与其他微生物培养一致的规律，均包括极速上升期、缓慢上升期、稳定期等生长阶段。土壤微生物群落 AWCD 随时间的变化可以反映植烟土壤微生物群落的活性，较直观地反映微生物群落的反应速度，及对碳源利用的程度，其值越高，表征土壤微生物群落代谢活性越强。本研究中，2个生长时期(团棵期和成熟期)的土壤微生物群落AWCD均表现为套作处理的显著高于对照，且在培养过程中，套作紫花苜蓿的AWCD高于套作小麦的。不同生长时期不同套作模式下土壤微生物在微平板上的AWCD和微生物代谢多样性指数与对照处理相比差异较大，说明套作对土壤微生物有显著影响[11]。王修忠等[12]的研究表明，烟田后期套作绿肥是南方烟稻复种区可行的绿肥种植模式之一，是控制上部烟叶烟碱含量和提高上部烟叶可用性，以及优化烟草土壤质量的有效途径。对照处理降低了土壤AWCD和微生物多样性指数，说明连作降低了微生物多样性，会影响土壤养分的可持续性发展，在生产中应尽量避免连作[13-14]。土壤微生物的Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数可以表征土壤微生物群落的多样性，能反映土壤微生物群落结构和功能的差异[11,15]。本研究中，套作处理与对照相比显著提高了土壤微生物群落的丰富度、均匀度、优势度，说明套作能提高植烟土壤的优势菌群。这可能是因为土壤微生物群落不仅受到植烟根系分泌物的影响[16]，而且还受到套作作物残茬还田对土壤养分的影响。植物根系及其残体向土壤中分泌大量有机物质，套作模式下植烟土壤有机质含量和组成的变化可能是影响土壤微生物碳代谢的重要原因[17]。另外，由于根系分泌物具有黏附作用[18]，套作还可以改善土壤孔隙度和土壤团粒结构，促进微生物菌群的增殖，使土壤微生物群落结构发生改变。

主成分分析结果表明，不同生长时期不同套作模式的土壤微生物群落功能多样性差异显著：与主成分1显著相关的碳源有6种，主要为糖类、其他化合物类，其次是氨基酸类、羧酸类；与主成分2显著相关的碳源有1种，是羧酸类。其中，比较敏感的碳源类型主要为糖类、其他化合物类和羧酸类[19]。有研究表明，土壤微生物群落在烟草栽培过程中会发生变化。有关作物轮作和休耕的研究表明，一般适合轮作的栽培作物包括禾本科和豆科植物[20-21]。本试验中，小麦为禾本科植物，紫花苜蓿为豆科植物。紫花苜蓿与小麦相比，对氮的固持能力更强，更有利于提高土壤C/N，便于微生物对土壤中过量的氮素进行固定，从而提高土壤的氮素供应能力，为微生物的繁殖提供充足氮源，进而改变土壤微生物群落结构[22]。

土地的利用方式对土壤微生物群落组成有重要影响[23]，时间变化也会改变土壤微生物群落的组成[24]。本试验中，团棵期与成熟期相比，土壤微生物对碳源的利用能力提升，利用种类增多。可能原因是，团棵期适宜的土壤温、湿度为微生物生长、繁殖和代谢提供了良好的代谢环境[25]；成熟期，较低的土壤温、湿度抑制了土壤微生物的生长，微生物的代谢能力减弱，土壤微生物的活性降低。同时，不同时期，腐解速度、田间持水量等因素的影响也不同，也可能是引起土壤微生物群落结构和功能多样性变化的原因[26]。

总体来看，合适的套作模式能提高植烟土壤的微生物群落多样性，显著提升微生物群落对Biolog微平板中碳源的利用能力。套作对植烟土壤微生物有显著影响，且套作紫花苜蓿对土壤微生物的影响优于套作小麦。综合来看，植烟套作建议选用豆科植物。植烟连作会降低土壤微生物的多样性和土壤微生物群落对碳源的利用能力，套作绿肥是一种更有效的烟草种植模式。