杨 娟1 杨忠苹2

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非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性和致死性的传染病[1，2]。该病感染率高，病死率可达100%，目前没有有效的疫苗和药物。该病自2018年8月1日，我国报告首例ASF发生以来[3]，疾病在国内迅速传播，目前在全国各省份都有发病案例，对我国养猪业造成了灾难性的影响[1,4]。

目前我国养猪业集约化水平偏低[5]，大量的散养户分散在全国各地村镇。而当前我国动物防疫体系整体力量依然非常薄弱，尤其在广大农村地区，基层防疫人员匮乏，在非洲猪瘟严峻的防疫形势之下，单纯从养猪业入手，要保证我国养猪业健康发展存在巨大的困难。

要做好非洲猪瘟防控，需要调动各方面的资源和积极性，从产业链各个环节入手。屠宰场作为生猪产业链的关键一环，是各地生猪汇聚之地，具有巨大的疫情传播风险；屠宰后的肉品流入到餐桌和下一个生产环节，也会持续的带来疫情风险。自去年至今，非洲猪瘟在我国快速扩散，一定原因在于私自屠宰发病猪和部分屠宰场管理不规范，被ASFV污染，通过生猪运输车辆携带病毒扩散。

使用高灵敏度的检测方法对待宰生猪进行宰前检疫，做好屠宰场非洲猪瘟防控。第一，可以防止非洲猪瘟阳性猪流入食品和生猪深加工产业链，减小非洲猪瘟进一步扩散风险；第二，可以倒逼上游规范采购和运输环节，减少非洲猪瘟阳性猪销售，降低非洲猪瘟病毒猪流通，加强运输车辆消毒，减少运输车辆传播风险；第三，通过进一步加强私屠滥宰整治，可以大大降低疫病扩散风险，加强食品安全。加强屠宰场防疫是打好非洲猪瘟攻坚战的关键环节，对于整个非洲猪瘟防控具有重要意义。

加强检测并对携带ASFV猪进行无害化处理是防控非洲猪瘟传播的重要手段，如何选择适合屠宰场使用的高效、快速、敏感、准确、经济的检测方法，是屠宰场防疫的难题。为此，本文对ASF常用的检测方法进行综述，以期为一线ASF快速检测，加强ASF防疫提供参考。

1 ASFV基因组检测

1.1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)作为一种经典的分子生物学方法，也是目前动物传染病领域使用最多的检测方法之一。根据ASFV基因组高度保守区针对性的设计特异性引物，对目标片段进行PCR扩增[6]，然后使用琼脂糖凝胶电泳检测核酸扩增产物，可以对ASFV病毒核酸进行检测。检测产物可以进一步测序或者酶切，提高检测准确性，并可以序列进行分析。

PCR方法应用广泛，但是作为一种必须持续使用的传染病检测方法，也具有其缺陷。第一，PCR方法检测敏感性相对较高，但是依然有较大提升空间，在检测混合样是敏感性有所欠缺；第二，PCR操作步骤依然较为繁琐，经过核酸提取、扩增、电泳分析步骤[7]，在操作成过程中容易出错，需要熟练的专业操作人员；第三，检测时间依然较长，从样本到出结果，完成全部检测时间约需3h；第四，PCR方法使用琼脂糖凝胶电泳开盖点样检测结果时，扩增片段很容易形成气溶胶污染实验室，并容易导致假阳性结果出现。

要做好PCR需在正规PCR实验室里进行，需要配备PCR仪、凝胶成像仪及琼脂糖凝胶电泳仪。屠宰场每天都需要检测，在高强度的检测情况下需要配备高标准的分子诊断实验室，严格的区分试剂保存区、样品处理区、核酸扩增区、产物分析区，所有区之间通过压差控制和传递窗使用杜绝气流直接流通，不同分区严格使用不同的物品，才能相对有效的降低污染，减少假阳性结果发生。

综上所述，传统的PCR方法用于屠宰场一线ASFV的快速、准确检测有缺陷。

1.2 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR解决了常规PCR方法敏感性低[8]、需要电泳操作复杂、开盖电泳易导致污染，操作时间偏长的问题，该方法敏感性高、特异性强[9]。通过配套便携式的荧光PCR仪与免提取的试剂，可以在生产一线大量推广使用，是目前非洲猪瘟防控生产实践中最重要的方法之一[10]。

现有很多qPCR商业化试剂盒检测非洲猪瘟病毒，操作简单，检测人员只需进行简单的加样后即可上机进行检测，操作步骤少、对操作人员要求较低。

qPCR实验室需要配置荧光定量PCR仪，对检测结果进行实时监控，能在1～1.5h检测完毕，便携式的荧光定量PCR仪也可以便捷的应用到生产一线进行快速检测。

qPCR检测技术敏感性非常高，使得qPCR容易被污染，导致假阳性。这就要求实验室的设计规范、实验过程中的工作流向正确、实验人员严格按照正规操作进行实验，对气溶胶污染的实验室严格进行消毒。在实验室检测时应严格区分试剂保存区、样品处理区、核酸扩增区，各区域严格独立，防止交叉污染；在生产一线操作时，应该在完全独立的房间和区域分开进行样品处理、反应体系配制和扩增工作。在实验过程中需要引入阴性对照来监控污染。

一线生产实验所选用的荧光PCR仪应该具有良好的性能。设备的升降温速率决定了反应时间；设备信号系统决定了检测的灵敏度；设备移动应不影响设备性能，免ROX校正；具备基线可调功能可以一定程度上减少假阳性问题。

总而言之，qPCR方法快速、准确，配套性能优异的检测设备和简便快速的免提取检测试剂已经成为非洲猪瘟病毒检测的最重要的方法之一。

1.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术[11](Loop-mediated isothermal amplificationL, LAMP)使用4条引物(特异识别靶序列上6个位点)及一种DNA聚合酶(具有链置换活性)，在等温条件(60～65℃)下45min左右进行核酸扩增，其扩增效率可达到109～1010个数量级，能检测到10拷贝质粒DNA，具有灵敏度高、等温扩增、操作简单和检测结果快速等优点，在临床检测中有一定推广前景[12，13]。

LAMP反应过程中不需要昂贵的仪器[14]，只需恒温水浴锅即可，适合现场及野外使用该方法。结果读取方面，可以使用浊度仪对反应产物进行浊度分析，获得阴阳性结果。目前多数LAMP检测试剂盒在反应体系中加入荧光染料，一旦检测出阳性结果在紫外灯照下可以发出绿色荧光。

LAMP技术对引物设计要求较高，尤其是要获得高度特异性的结果，存在一定难度。样品处理、反应和结果分析过程中也可能出现交叉污染，产生假阳性的结果。这要求在实验过程中严格分区，严格消毒，避免气溶胶污染。

1.4 重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种核酸等温扩增技术[15]。该技术是2006年英国TwistDx Inc公司研发的，它最大的优势是可在25～43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，在5～20min观察结果[16]。RPA技术对实验室设备要求低，扩增操作简单，仅需向反应体系中加入提取好的核酸样品模板及引物即可扩增。

RPA产物可通过结合探针(实时荧光定量RPA)或横向流动试纸条(LFD)等方法实现扩增产物的定量分析或可视化判别。RPA反应试剂可以冻干形式保存，便于运输及保存，适合现场和野外检测。作为非洲猪瘟病毒的检测，RPA技术有较大的优化和应用空间，作为一种操作简便、检测时间短、灵敏度较高、无需精密仪器的检测技术[17]，是一种具有广泛应用前景的快速分子诊断工具，可以在防疫现场检测中推广[18]。

2 ASFV抗体检测

目前仍无有效的疫苗预防ASF，对于非洲猪瘟病毒抗体检测不存在疫苗抗体干扰的问题[1]。感染ASFV强毒株的猪在产生抗体前已经死亡，若检测到ASFV抗体，通常表明是感染低毒力或中等毒力ASFV毒株，或者猪具备相应抵抗力有一定几率耐过。被ASFV感染初期的猪抗体检出率低，甚至检测不到抗体。但随着疾病的持续、广泛传播，ASFV抗体检出率可能越来越高，因此ASFV抗体检测适应于ASF带毒筛查、ASF的复栏监测，净化阶段检测以及非AFS疫区国家的进口检疫监测。

2.1 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA)是血清学检测中常用的技术。可检测血清和浸出液，该方法显著特点是速度快、成本低，适用于大量样本的快速筛查[19]，是国际贸易指定的检测方法[1,8]。

ELISA方法可以根据需要，开发检测ASF病原或者抗体的试剂盒。ELISA病原检测试剂盒，该方法敏感性相对荧光PCR技术相对要低，但是好的ELISA试剂盒可以大幅度降低假阳性问题，ASFV抗原ELISA试剂盒可以作为一种辅助的监测手段。

当前还没有非洲猪瘟疫苗，检测出非洲猪瘟抗体即代表感染ASFV。部分ASFV感染耐过猪，体内有ASFV抗体，但是病原下降，可能无法检出ELISA抗原，甚至无法通过荧光PCR方法检出核酸。在疫病防控过程中使用ELISA抗体检测试剂盒进行筛查也有一定意义。

ELISA检测方法操作较为简单，需要使用酶标仪，通常在实验室由熟练的专业实验人员来进行。

ELISA检测感染ASFV后第一周内的样品，缺乏敏感性，因此该方法不适于作为早期检测。但对于复栏监测、净化阶段检测以及进口检疫监测具有重要的作用。

2.2 间接荧光抗体试验

间接荧光抗体试验(Indirect Fluorecent Antibody Test, IFA)可用于检测感染ASFV猪的血清、血浆或组织分泌物中的抗体。该技术的原理是用具有细胞适应性的ASFV毒株，感染单层绿猴肾细胞，再通过特异性抗原抗体反应实现对ASF抗体的检测。在荧光显微镜下，阳性样本在感染细胞的胞浆中出现特异性的荧光[1]。IFA适用于无ASF流行地区检测阳性的血清，以及经ELISA检测无法确定结果的血清确证试验[20]。

IFA检测结果比ELISA检测准确，但耗时长，且结果判定需要借助荧光显微镜。ASFV作为列入OIE传染病名录的重大传染病，只有特殊的经过国家许可的P3以上的实验室才能操作ASFV病毒，该方法只能在极少数实验室使用。

2.3 间接免疫过氧化物酶试验

间接免疫过氧化物酶试验(Immune Peroxidase Technique, IPT)是一种细胞免疫技术。在IPT反应过程中，绿猴肾细胞被ASFV毒株感染。感染细胞先被固定，之后用作抗原以确定样品是否存在针对ASF的特异性抗体。与FAT检测一样，IPT作为敏感、特异的快速检测技术，适用于从血清、血浆或组织渗出液中检测ASF抗体。FAT检测技术因用了酶学显色，结果判定比IFA更简单[1]。

IPT对实验人员要求很高，需要很丰富的经验，并且实验步骤复杂，很难在基层实验室进行。同时开展ASFV的IPT检测也只能在极少数经过授权的特殊实验室才可以进行。

3 展望

非洲猪瘟在我国爆发以来，对养殖业造成巨大损失，加强检测，早发现、早处理成为防控该病的重要步骤。因此，实验室检测技术在防控非洲猪瘟中体现出至关重要的作用。目前，ASFV的检测主要从病毒核酸和病毒免疫学两方面进行。OIE推荐检测ASFV的方法主要有PCR、qPCR、ELISA等。病毒核酸检测，特别是qPCR在早期检测中发挥着不可替代的作用。抗体检测可以了解ASFV感染、发生、发展的进程，但抗体只有在病毒感染至一定时期后才会检测到，具有一定的滞后性。随着分子生物学和免疫学技术的不断发展，ASFV实验室检测方法不断完善，进一步为生产实践中ASFV检测方法提供技术支持。

ASFV检测方法多种多样，各有优缺点[13]。屠宰场对非洲猪瘟检测方法的选择应注意以下三点：第一，选择快速、准确、敏感、操作简便的检测方法，比如qPCR；第二，应选用两种及以上的检测方法，更准确的判定是否携带ASFV；第三，对于出现ASF临床症状的猪应结合免疫学检测。

皮之不存毛将焉附，当前我国养猪业到了生死存亡的关头。选用性能优异的设备，敏感的方法对待宰生猪进行宰前检疫，对感染动物进行紧急无害化处理，降低ASFV扩散，防止ASFV感染猪流向下一个环节，有效防控好非洲猪瘟，对于屠宰行业的持续良性发展具有重要意义。加强非洲猪瘟检测，做好非洲猪瘟防疫是当前屠宰企业的责任担当和社会价值体现。