曹 丁， 李学优， 肖宏艳， 昝继清

（广州市微生物研究所，广东广州510663）

近年来家禽肿瘤和病毒感染引起的鸡马立克病、新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎等烈性传染性疾病呈地方性流行趋势，每年造成数十亿元的经济损失，是当前养禽业发展的大敌，如何有效治疗家禽肿瘤和病毒感染性疾病一直是困扰禽病防治的重大难题之一（蔡梅红等，2007）。 对于兽用抗病毒生物制品来说，与传统的化学药物和疫苗相比，干扰素（IFN）作为免疫应答的自然介导物和调节物之一，具有广谱的抗病毒活性，在临床上具有良好的应用前景（Galligan 等，2006）。尤其是鸡a干扰素是一种抗病毒性较强的生物制品，具有作用广泛、残留小、几乎无毒性等特点，为这些疾病的防治提供了新的手段（Platanias 等，2005）。

目前国内对于鸡a 干扰素的研究多数处于实验室阶段及小试水平， 对于其下游大规模高密度发酵技术研究缺乏， 其生产还存在着生产成本过高、表达效价低、工艺控制复杂、生产稳定性差、养殖业对其用量大等问题，难以实现规模化生产（岳道友等，2010）。

本课题组前期构建了含有鸡α 干扰素优化基因的真核表达载体pPIC9k，并将其5＇端非翻译区（5＇UTR）序列进行改造，去除多余的8 个碱基序列，使其与毕赤酵母AOX1（醇氧化酶）的mRNA 序列完全一致， 并初步研究了改造载体在毕赤酵母SMD1168 中的表达和抗病毒活性，在摇瓶水平其抗病毒活性达到1.5×106U/mL。 本研究在此基础上，在500 L 中试水平，通过研究pH、装液量、溶氧、诱导条件等因素对毕赤酵母工程菌发酵产鸡α 干扰素的影响，优化一套成熟的产鸡α 干扰素的毕赤酵母高密度发酵工艺，为鸡α 干扰素的放大生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌 鸡α 干扰素重组毕赤酵母菌SMD1168-pPIC9k-cIFN-α，由广东省微生物种质资源库保存并提供。

1.2 主要试剂及培养基 种子培养基： 葡萄糖20 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH=7.0，固体培养基加2%的琼脂粉。 发酵培养基：甘油46 g/L，磷酸二氢铵14 g/L，硫酸钾18 g/L，硫酸镁15 g/L，硫酸钙1.5 g/L，磷酸二氢钾5 g/L，氢氧 化 钾1.5 g/L，PTM 盐4.4 mL/L， 初 始pH 为6.96。

酵母抽提物；胰蛋白胨（英国Oxoid 公司）；琼脂粉（广州环凯生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器设备 生化培养箱: 上海一恒科学仪器有限公司；DHZ-DA 大容量全温振荡器：太仓市实验设备厂；5427R 高速冷冻离心机：eppendorf；50、500 L 不锈钢发酵罐：上海洋格生物设备有限公司。

1.4 菌株培养方法 将斜面保存的毕赤酵母菌株接种于种子培养基中，于30 ℃、150 r/min 培养24 h， 然后以5%的接种量接种于50 L 发酵罐中进行扩大培养，培养温度为30 ℃，通风量1000 ～2500 L/h，罐压0.06 MPa，搅拌转速200 ～350 r/min，培养至30 h，OD600达到35 以上后，以10%的接种量过种至500 L 发酵罐中， 培养温度为30 ℃，通气搅拌培养，溶氧控制在30%以上（通过调节风量和转速控制），罐压0.06 MPa，当初始碳源耗尽时，开始流加甘油，当菌体量积累到一定程度时，开始脉冲流加诱导剂进行诱导表达， 发酵过程分别取样在线监测各种生理指标。

1.5 指标测定

1.5.1 菌体生物量测定 根据发酵液活菌数的对数值和菌体湿重成一定的线性关系原理， 通过测其湿重指标来间接反映菌体的生长情况。 测定方法如下：取适量发酵液，离心洗涤两次，测定单位体积发酵液的菌体重量即为菌体湿重（g/L）。

1.5.2 pH 测定 用PHS-25 数显酸度计测定。

1.5.3 甘油浓度测定 采用HPLC，岛津LC-20A液相色谱仪，氨基柱；流动相：5 mmol/L 硫酸，流速：0.6 mL/min ；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测器：示差折光检测器；采用外标法定量。

1.5.4 甲醇浓度测定 采用HPLC，岛津LC-20A液相色谱仪，氨基柱；流动相：5 mmol/L 硫酸，流速：0.6 mL/min ；柱温：65 ℃；进样量：20 μL ；检测器：示差折光检测器；采用外标法定量。

1.5.5 鸡α 干扰素抗病毒活性的测定 参考蔡梅红等（2010）的方法，采用细胞病变抑制法进行测定。

2 结果与分析

2.1 pH 对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响 在50 L 罐发酵水平，用氨水和磷酸维持发酵过程不同的pH，在优化培养基中，菌体增殖温度为30 ℃，诱导温度为28 ℃，装液量为60%，通风量1000 ～2500 L/h， 罐压0.06 MPa， 搅拌200 ～350 r/min，接种量为10%。 培养过程中随着菌株的生长，培养基中的碳源逐渐消耗，当碳源消耗完后菌体不再生长，溶氧开始上升，根据溶氧恒速流加甲醇进行诱导60 h 后放罐，结果如图1。

图1 pH 对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响

图1 显示，维持pH 5.5 条件下，发酵48 h，细胞湿重达到168.6 g/L，产物鸡α 干扰素（IFN-α）抗病毒活性达到1×107U/mL。虽在pH 6.0 条件下获得的细胞湿重与pH 5.5 相比更高，但产物抗病毒活性相对较低，所以选择维持pH 5.5 进行后续试验。

2.2 装液量对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响 鉴于装液量对于工程菌发酵的重要性（影响营养物及氧气的传递性能），考察了50 L发酵罐中不同装液量 （80%、70%、60%、50% 和40%）对菌体合成及鸡α 干扰素表达的影响，其他条件不变。 结果表明（图2），随着装液量的增加菌体合成量大致呈下降趋势。而在装液量为50% 条件下，获得较大菌体量，并且产物获得了最高的抗病毒活性（1.5×107U/mL）。 在40% 装液量条件下的发酵液经镜检发现大量细胞碎片的存在， 推测原因可能是在相同搅拌功率条件下， 随着装液量的减少，单位体积功率系数（P/V）将增大，从而对菌体细胞产生较大的剪切力，造成细胞破碎（姜正军等，2014）。因此选择装液量为50%进行后续试验。

2.3 溶氧量（DO）对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响 用50 L 发酵罐进行多批次的溶氧试验， 通过调整转速和通风量的大小并通入合适浓度的纯氧来控制溶氧DO 值的高低， 使溶氧分别控制在10% ～20%、20% ～30%、30% ～40%、40% ～50%，其他条件不变，根据溶氧恒速流加甲醇进行诱导60 h 后放罐，测定干扰素活力确定最佳溶氧量，结果见图3。

图2 装液量对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响

图3 溶氧量对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响

从图3 可看出，随着溶氧量的上升，菌体的生物量和表达蛋白的抗病毒活性都有不同程度的提高，但过高的溶氧量反而会抑制菌体生长和蛋白质表达。当发酵罐DO 值控制在30% ～40%时，菌体生物量最高，为185.4 g/L；当发酵罐DO值控制在20% ～30%时，干扰素的抗病毒活性最高，为2×107U/mL，因此选择诱导表达的DO 值为20% ～30%， 在菌体增殖阶段可适当提高溶氧量为30% ～40%。

2.4 诱导前菌体浓度对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响 初始培养基中碳源耗尽后，菌体不再生长，溶氧量开始上升，此时开始流加碳源甘油。 通过控制流加甘油速度和时间不断提高菌体浓度， 使诱导前菌体浓度分别达到250、300、350、400、450 g/L， 其他条件不变， 根据溶氧恒速流加甲醇进行诱导60 h 后放罐，通过测定表达上清抗病毒活性确定最佳诱导前菌体浓度，结果见图4。

图4 诱导前菌体浓度对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响

在一定范围内， 毕赤酵母菌体浓度的提高有利于提高蛋白的表达量和活性，图4 显示，当诱导前菌体浓度为400 g/L 时， 诱导发酵60 h 后，干扰素的抗病毒活性最高，达到2.5×107U/mL，过高的诱导前菌体浓度一定程度上抑制了干扰素蛋白的表达， 可能跟溶氧或是营养物质的传递不足有关。 因此，选择诱导前菌体浓度为400 g/L 为宜。

2.5 诱导剂添加模式对毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素的影响

2.5.1 诱导剂配方的选择 在初始碳源耗尽后，通过连续流加甘油使其菌体浓度达到400 g/L，其余发酵条件不变， 根据溶氧恒速流加如下不同配方的诱导剂：（1）50%质量浓度的甘油：甲醇=1：4；（2）50%质量浓度的山梨醇：甲醇=1：4；（3）分析纯甲醇。 诱导发酵60 h 后，测定发酵上清的抗病毒活性。

从表1 可看出，用甲醇和甘油混合诱导，菌体浓度较高， 分泌干扰素抗病毒效价高于只用甲醇诱导；用甲醇和山梨醇混合诱导，菌体浓度略低于甲醇和甘油混合诱导组， 分泌干扰素抗病毒活性高于甲醇和甘油混合诱导组， 说明山梨醇可以明显提高毕赤酵母分泌蛋白的活性。 因此选择甲醇和山梨醇混合作为诱导剂。

表1 不同诱导剂对干扰素活性的影响

2.5.2 诱导剂添加模式的选择 毕赤酵母工业化大规模发酵时， 诱导剂补料方式基本分为分批式补料、连续式补料等，据此确定以下3 种诱导剂添加方案进行诱导表达（张晓龙等，2015）：（1）分批式补料，每次补入0.4%诱导剂，待甲醇消耗完后继续补料；（2）分批-连续式补料，诱导初期加入0.4%诱导剂，甲醇消耗完后， 继续补加0.4%诱导剂，5 h 后控制流速为5 ～6 mL/（L·h）；（3）连续式补料， 诱导初期补料速度为1 mL/（L·h）， 每小时提升一个单位，5 h 后控制流加速度为5 ～6 mL/（L·h）。 诱导过程中每6 h 取样测定发酵上清的抗病毒活性，结果见图5。

图5 不同诱导剂添加方式对干扰素活性的影响

从图5 可看出，采用连续补料的方式可以使毕赤酵母更好地适应甲醇，延长最佳表达周期，干扰素最高抗病毒活性可达到4.0×107U/mL；而采用分批补料的方式， 受甲醇初始浓度过高影响， 毕赤酵母前期未能适应碳源变化， 导致36 h 后外源蛋白停止表达，诱导期明显缩短；采用分批连续补料的方式，有助于蛋白表达，但前期变换碳源过渡不佳， 导致发酵后期干扰素效价不高， 因此采用连续补料的方式进行鸡α 干扰素诱导表达。

2.6 50 L 发酵工艺的确定 通过研究接种量、温度、初始pH、装液量、过程pH 控制、溶氧等因素对工程菌发酵产鸡α 干扰素的影响，初步得出最佳发酵工艺为接种量10%，装液量50%，菌体增殖阶段：控制pH 为6.0，发酵温度为30 ℃，溶氧为30% ～40%， 当初始培养基中碳源耗尽后，菌体不再生长，溶氧量开始上升，此时开始流加碳源甘油，使诱导前菌体浓度为400 g/L；诱导表达阶段： 控制pH 为5.5， 发酵温度为28 ℃， 溶氧为20% ～30%，用50%质量浓度的山梨醇：甲醇=1：4的诱导剂，采取连续补料方式，诱导初期补料速度为1 mL/（L·h）， 每小时提升一个单位，5 h 后控制流加速度为5 ～6 mL/（L·h）， 此过程根据溶氧控制流速，发酵60 h 结束。

在最优发酵工艺下，进行50 L 发酵罐水平毕赤酵母发酵表达鸡α 干扰素验证试验，重复5 批次，结果显示（表2），毕赤酵母在50 L 发酵水平进行高密度发酵表达鸡α 干扰素，发酵过程各项参数重现性较好，表达的蛋白活性稳定，具有工业化生产价值。2.7 500 L 发酵工艺的确定 在50 L 发酵工艺的基础之上， 对毕赤酵母工程菌株进行了500 L罐发酵扩大生产， 主要考察发酵工艺的稳定性和验证扩大培养后干扰素的抗病毒活性， 试验重复5 批。结果显示（表3），在最优发酵工艺下，毕赤酵母在500 L 发酵罐水平，当发酵24 h，初始碳源耗尽时，菌体湿重为178.9 g/L，此时开始补加甘油，甘油初始流速为3 mL/（L·h）， 每小时提升1.5 单位，5 h 后控制流加速度为10 ～12 mL /（L·h），发酵时间42 h 时，菌体湿重为412.3 g/L，此时开始补加诱导剂，干扰素效价开始增加，到发酵96 h时达到最高，为4.5×107U/mL，之后略有下降，菌体湿重有少量增加，之后保持相对稳定的状态，因此发酵时间应控制在诱导表达60 h 后放罐。 与50 L 罐上的各项发酵过程参数相比，500 L 罐发酵过程各项目标参数变化趋势与50 L 较一致，结果重现性较好，生产过程各项参数较为稳定，且目的蛋白表达量略高于50 L 罐，分泌的鸡α 干扰素的抗病毒活性最高为4.8×107U/mL， 可进行稳定的工业化生产。

表2 50 L 发酵毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素过程稳定性

表3 500 L 发酵毕赤酵母高密度培养表达鸡α 干扰素过程稳定性

3 结论与讨论

影响毕赤酵母高密度发酵表达外源蛋白的因素很多，本研究在前期试验的基础上，选取了中试放大过程中几个关键因素进行优化。 毕赤酵母高密度发酵需要大量的溶氧， 充足的氧气对诱导阶段外源蛋白的表达极为重要（闵兆升等，2014）。有报道认为，如果采用大型发酵罐进行培养，外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶高出10 ～100 倍（Withers 等，1999）。若溶氧不足，不仅会限制菌体生长， 发酵过程中还会产生甲醛和过氧化氢等有毒代谢产物，产生生物安全问题；若氧气过量同样会抑制菌体产生目标蛋白。 本研究采用按一定比例通入纯氧和空气的方式来保证足够的溶氧，控制DO 值在合适的水平。

另外， 诱导前菌体浓度对异源蛋白的表达也有影响。毕赤酵母中蛋白质表达分为两个阶段，首先是在含有甘油的培养基中生长菌体， 达到一定的菌体浓度，理论上是菌体越多，培养基中氧和营养供给越受限制。 事实上高密度不一定有利于外源蛋白的产生，这跟表达的外源蛋白的性质，如溶解性、稳定性、毒性等以及发酵罐能提供的最大供氧量相关（Besse 等，1997）。本试验发现，在菌体湿重低于400 g/L 时，外源蛋白较难降解，能有较高水平的表达量。

以甲醇作为诱导剂不但可以诱导AOX 启动子驱动外源蛋白的表达， 也可以作为碳源维持表达过程的能量消耗。研究表明，甲醇还可以与山梨醇和甘油混合补料诱导表达， 一方面可增加碳源和能量供给，利于菌株生长和蛋白质表达；另一方面可降低产热和耗氧速率， 从而提高蛋白质表达（林俊涵，2009）。但甘油对AOX1 启动子有阻遏作用，采用山梨醇和甲醇作为诱导剂，可减弱这种抑制作用， 还能够减缓目的蛋白的胞外降解及降低毒副产物的积累， 同时产热值更低 （Calik 等，2009）。 研究表明，山梨醇和甲醇混合流加的策略不但可以增加细胞密度、缩短诱导时间，还能够提高外源蛋白的表达量（武婕等，2016），这也与本研究的结果一致。

本研究通过观察pH、装液量、溶氧、诱导条件等因素对工程菌发酵产鸡α 干扰素的影响，得出一套毕赤酵母高密度中试扩大发酵工艺，用此工艺条件可实现500 L 规模发酵生产鸡α干扰素，并且工艺稳定，鸡α 干扰素的抗病毒活性可达到4.5×107U/mL 以上， 优化发酵工艺跟初始发酵工艺相比，生产成本降低55%，发酵效价提高了3.5 倍， 并且培养基组分成本较低，适合规模化生产。 本研究将改变鸡α 干扰素难以规模化生产的现状，大幅度降低生产成本，在同类产品中的市场竞争力将大大提高， 同时可以解决禽畜疫病防治过程中的抗生素滥用和疫苗滴度低的问题， 提高我国禽类养殖业的健康水平。