李红梅, 张勤奋, 李茵茵, 张楚英, 张子健, 张以顺

(中山大学 a.生命科学学院；b.华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤防治中心，广州 510275)

0 引 言

光学显微镜和电子显微镜都是探索微观生命活动的重要工具，并提供了丰富的蛋白质定位、动力学以及细胞超微结构等信息[1]。自17世纪光学显微镜诞生以来，显微镜就一直是生物学家从事研究、探寻生命奥秘必不可少的利器[2-3]。透射电子显微镜的特点是分辨率高，对细胞的超微结构观察具有极大的优势，但缺点是没法观察活细胞、景深和观察范围小[1-3]。相反，光学显微镜具有景深大、观察范围广，能进行活细胞观察等特点[4-5]，结合免疫荧光技术在以蛋白、脂质或者离子作为靶标来探索细胞生理活动，其应用几乎渗透到所有的细胞和分子生物学中，在细胞结构或组分的定位与半定量研究、活细胞在时间轴上的变化、脂膜的流动性分析、药物筛选等方面研究有着重要贡献[6-7]；激光共聚焦显微镜和超高分辨显微镜还可以获得三维的图像[7-8]，可以更好地了解细胞活动过程。跟其他仪器一样，光学显微镜也有其技术缺陷，与透射电镜相比，最突出的一点是其分辨率不够高，普通光学显微镜的极限分辨率是200 nm，几经发展，目前超高分辨荧光显微镜的分辨率提高了一个数量级，达到10 nm左右[9-11]。因此，光学显微镜和电子显微镜的联用(光电联用)能很好地弥补各自的缺点，可在原位获得更多更全面、更精细和高分辨的细胞信息，近年来受到了广泛的关注，尤其是冷冻光电联用快速发展，也出现了一些尚未完全成熟且价格昂贵的光电联用配套设备。总体而言，光电联用技术对生命科学相关学科非常重要，但该技术还在不断发展中。

本文尝试使用大多数生命科学相关实验室能得到的光学显微镜和最常用的生物电镜设备，进行光电联用，对处于分裂中期(M期)细胞进行观察。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及处理

采用刻有网格标记的培养皿μ-Slide CorrSight Live(ibidi，德国)培养细胞。培养皿共6个孔，每个孔中有横向编号A-Z-a-e共31个数字，纵向编号从1～30，共900个小格，每个小格长度为100 μm，小格中可容纳多个细胞。使用加有血清的普通细胞培养基(Gibico)。细胞采用已有稳定表达内质网驻留绿色荧光蛋白ER-EGFP 和融合红色荧光的组蛋白H2B-mCherry的HeLa细胞。通过胸腺嘧啶核苷双阻断法配合RO3306阻滞释放获得分裂中期(M期)细胞。

1.2 光学显微镜观察

首先在倒置荧光显微镜(IX73，OLYMPUS)的透射光明场下观察，物镜为10×PH。初步观察细胞分布情况后，再在配有数值，孔径为100×/1.49的油浸透镜和固体激光器(488、561、647 nm)的超分辨显微镜(Nikon)上观察，用ORCA-Flash 4.0(HAMAMATSU)数码相机采集荧光图像(见图1)，并且记录目标细胞所处的网格位置。再根据在超分辨显微镜观察记录的信息返回倒置显微镜，获取更加详细的定位信息，包括周围细胞形态、数目分布等环境信息。

1.3 透射电镜样品制备及观察

将上述带有目标细胞的培养皿，连同上面的培养细胞进行原位样品制备，用2.5%戊二醛2%多聚甲醛混合固定液4℃固定过夜后，吸弃废液，用PBS(0.1 mol/L, pH 7.4)洗3次；1%的四氧化锇(OSO4)常温下固定1 h；回收OSO4废液；再次用磷酸盐缓冲液(PBS)(0.1 mol/L, pH 7.4)洗涤3次，每次10 min；乙醇溶液梯度脱水；浓度从低到高的SPI-812环氧树脂进行渗透后，将事先用0.5 mL离心管盛装的树脂聚合成棒的粗的一头削平，并轻轻倒扣在培养皿，接触培养皿中的包埋剂(尽量避免气泡产生)。由于其直径和所使用的培养皿孔的差不多，树脂棒一般在皿口位置，不会接触细胞。放置于烘箱60℃聚合24 h。

图1 荧光显微镜和透射电子显微镜在细胞观察中联用的实验过程

聚合好的树脂通过先加热后放进液氮中冷却的方法，将原来用于支持细胞的培养皿材料从聚合好的样品块剥离，借助网格标记锁定目标细胞，用削块机修去多余的部位。在超薄切片机(Leica EM UC6)用钻石刀(Diatome)切成约100 nm厚的超薄切片。经2%的醋酸双氧铀和3%柠檬酸铅双染色。最后在透射电镜(JEM-1400)下观察。整个过程的流程图见图1。

2 结果和讨论

2.1 光学显微镜观察结果

首先在倒置荧光显微镜的明场下观察，可看到所培养的细胞少部分呈分散分布，大部分成团单层分布，一个小格可有多个细胞(图2(a))。虽然在同一培养皿中加入药物处理细胞，但并不是所有的细胞都被阻断在M期，有的细胞仍处在分裂间期。荧光显微镜检查发现，M期细胞所占比例并不高。分裂间期的细胞有明显的细胞核，部分内质网紧紧围绕在细胞核周围(图2(b))。进入M期的细胞，细胞核内的遗传物质聚集形成多个小团，内质网绕着成团的染色体存在(图2(b))。

图2 光学显微镜下的细胞分布、形态结构

(a)倒置显微镜下的细胞分布；(b)图(a)局部放大图；(c)左侧细胞为分裂间期细胞，右侧为M期细胞。可以看到M期细胞中染成红色的组蛋白成团块状分布在细胞中，周围有绿色标记的内质网分布。绿色EGFP标记内质网；红色mCherry标记组蛋白

2.2 透射电镜观察结果

透射电镜下，同样可以观察到两种细胞形态同时存在。处于分裂间期的细胞(见图3(a)，3(b))和处于细胞分裂M 期的细胞(见图3(c)，3(d))。电镜中观察可发现两种状态细胞的内质网长度具有明显不同。分裂间期细胞的内质网相对短，且有的地方内质网成锁链状，也没有形成片层状结构环绕细胞核。而M期细胞的内质网相对较长，成片层状结构环绕着细胞核物质分布；此外，细胞内的线粒体、溶酶体等结构也可以在电镜图像中观察到。有些线粒体发生空泡化现象，这些可能与实验中使用药物或培养时间过长有关。

图3 电镜下HeLa细胞被阻断在分裂中期和在分裂间期的细胞形态

(a)分裂间期细胞。(b)图(a)细胞的局部放大，可见线粒体、内质网和溶酶体等。(c)M期细胞；(d)图(c)局部放大。N：细胞核，黑色箭头：内质网，白色箭头：溶酶体，五角星号：染色体，M：线粒体

2.3 光电联用观察结果

为了把光学显微镜和电镜观察结果对应起来，实验中进行了光电联用的尝试。首先借助荧光标记，在488 nm和561 nm波长的激发光下可以看到红色荧光蛋白标记的染色体/染色质和绿色荧光蛋白标记的内质网，通过超高分辨显微镜找到被阻滞在M期的细胞，采用ORCA-Flash 4.0数码相机采集荧光图像(图4(a))，同时记下该细胞所在位置(D孔21CD小格间)。从荧光图像可以看到目标细胞的染色体和包绕在其周围的内质网。转换到在倒置显微镜，在D孔21CD间的位置找到目标细胞，观察细胞所处环境(图4(b))，该处周围有3团细胞，目标细胞处于其中一个细胞团的边缘，目标细胞相邻的一团细胞有个较大的梭形细胞，其形态特殊，可作为突出标志帮助后续定位。而后经过原位固定、脱水和包埋聚合。切片前，首先根据培养皿标记，确定靶标细胞所在部位，定位后对周围进行修块处理，最后进行超薄切片，染色后透射电子显微镜下观察。电镜下已不可能有培养皿的网格标记，此时倒置荧光显微镜下观察到的细胞的形态及其周围细胞的形态、分布可作为依据，帮助找到对应的目标细胞。本实验倒置荧光显微镜下看到的那个大梭形细胞就可用来作为辅助靶标，帮助确定最后目标细胞(图4(c))。实验中该目标细胞的结果显示内质网长长地包绕在染色体外(图4(d))，这些结果跟荧光显微镜观察的结果一致。同时，电镜下还观察到目标细胞具有呈典型的M期细胞特征，细胞核内染色体结构明显，核周没有明显的核膜结构。此外还可看到细胞内的线粒体等亚细胞结构。

图4 光电联用实验结果

(a)超高分辨显微镜获得的M期细胞，绿色：内质网；红色：染色体。(b)经戊二醛固定后在倒置显微镜获得的图像，目标细胞在21排的C和D列间(箭头所示)，在其右侧(21D)有一个圆的细胞和一个梭形细胞(三角形箭头)。(c)透射电镜较低倍数的图像。图中有个明显的梭形细胞(三角形箭头)，下方有3个细胞，根据(b)图可以确定箭头所示的目标细胞；(d)目标细胞的常规电镜图像

3 结 语

实验结果表明，利用有标记的细胞培养皿、常规化学固定、常温常规光学显微镜和电镜等耗材和设备，可以进行光电联用的研究并成功获得结果。这对大多数农林、生命科学、医学等相关学科的普通电镜使用来说，一方面可以帮助获得一些重要的结果；另一方面，本实验使用的方法具有方便、成本低、易操作等特点，可以一定程度上为缺乏冷冻电镜和冷冻光电联用设备实验室提供解决很多科研问题的新方法。