晋春霞，肖亚朋，习向锋，杨沛沛，孙哲，王杰，王迎迎，赵坤坤，刘守川

（洛阳中科基因检测诊断中心有限公司，河南洛阳 471003）

鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）又称甘布罗病，是由鸡传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触传染性疾病[1]。邝荣禄于1979 年在广州首先发现我国存在该病，此后北京、上海、广东等地也发现了该病[2，3]。由于该病发病突然、病程短、死亡率高，且可引起鸡体免疫抑制，目前仍然是养鸡业的主要传染病之一。1987 年比利时北部和荷兰南部均发现IBDV 超强毒株，我国于1990年后也有报道分离到超强毒株与变异株，给养禽业造成了一定的经济损失[4]，同时给本病的防控也带来了难度。

疫苗免疫仍是目前最常用且最有效的手段之一，国内本病的商业化疫苗众多。常用的有活苗和灭活苗两大类，活苗有全病毒弱毒疫苗（包括抗原抗体复合物疫苗）和基因工程亚单位活载体疫苗；灭活苗有全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。灭活苗包括单苗和联苗，主要以联苗使用为主。市场上有多家商品化死苗，但质量孰优孰劣难以主观评判。本试验选用四种商品化IBD 死苗进行免疫效果评价，现将研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 疫苗

4 种商品化疫苗，分别标记为A～D，其中A 为IBD 亚单位灭活联苗，B～D 为全病毒灭活联苗，均购自市场。

1.2 攻毒毒株

IBDV BC6/85 株，购自中国兽医药品监察所。

1.3 实验动物

1 日龄SPF 鸡，由购自山东斯帕法斯公司的SPF 种蛋自行孵化而来。

1.4 检测试剂

IBD 标准琼扩抗原，批号201603，标准阳性血清，批号201701，购自中国兽医药品监察所；IBD ELISA 抗体检测试剂盒，批号LN448，购自IDEXX 公司。

1.5 方法

1.5.1 试验设计

用54 只1 日龄SPF 鸡，分6 组，A-E 组每组10只，F 组4 只（见表1）。A～D 组分别颈部皮下接种疫苗，0.2mL/只，E 组、F 组不免疫。免疫后14、21、28 日，分别翅下静脉采血，分离血清，测定IBD 的琼扩抗体、ELISA 抗体。免疫后30 日，除F 组外，各组试验鸡用IBDV 标准强毒BC6/85 株点眼攻毒0.1mL（含100BID），各组隔离饲养。每日观察并记录各组试验鸡发病和死亡情况，至攻毒后96 小时剖杀所有试验鸡，观察法氏囊病变。法氏囊病变的判定标准：法氏囊出现肿大、萎缩、出血、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变。

表1：试验分组情况

1.5.2 IBD 琼扩抗体测定方法

称取琼脂糖1g，氯化钠8g，倒入100mL 蒸馏水中混匀加热溶解后，将其倒入90mm 洁净玻璃平皿中，每个平皿20mL，静置冷却凝固后即为琼脂平板；用梅花打孔器在所制备的琼脂平板上打孔，中心与外周孔径均为3mm，中心孔与外周孔间距也为3mm，封底后进行加样；中间空加入 IBD 标准琼扩抗原，外周孔分别加入阴性对照、不同倍数稀释的阳性血清、不同倍数稀释的被检血清；标记清楚倒置于湿盒中37℃孵育72h 判定结果。阴阳性对照成立的条件下，被检血清与抗原产生沉淀线的最高稀释度即为该血清的AGP 效价。

1.5.3 IBD ELISA 抗体测定方法

按厂家说明书进行。简要步骤如下：试剂回温后进行稀释样品、加样，加样布局标记清楚，加好样品的反应板放18～26℃孵育30min，洗板后加入酶标抗体，18～26℃孵育30min，再次进行洗板后加入底物，18～26℃避光静置15min 孵育显色，加入终止液在酶标仪读数后进行计算。

2 结果

2.1 抗体检测结果

免后14 日仅D 组可检测到IBDV ELISA 抗体，抗体阳性率为80%，其余组抗体均为阴性；免后21 日A-D组均检测到抗体，但仅C 组和D 组抗体阳性率在80%以上；免后28 日抗体阳性率与21 日情况相同（见图1）。从ELISA 抗体平均效价（GMT）可看到，无论是免后21日还是28 日，D 组最高，C 组次之（见图2）。

AGP 抗体与ELISA 抗体产生情况基本一致。免后14 日A～D 组均可检测到IBDV AGP 抗体，但阳性率均在30%以下；至免疫后21、28 日，仅C 组和D 组抗体阳性率在80%以上（见图3）。从AGP 抗体平均效价（GMT）看，免后14～28 日，各组抗体呈逐步上升趋势，但以D 组抗体水平最高，其次是C 组（见图4）。

2.2 攻毒保护结果

免后30 日攻毒，攻毒后96h 剖杀，观察法氏囊病变。结果空白对照组试验鸡均未见任何临床表现，法氏囊正常（见图5A）；攻毒对照组试验鸡100%发病，出现精神沉郁、羽毛蓬松等临床表现，剖检后法氏囊均有明显病理变化（见图5B），取法氏囊用固定液固定后进行免疫组化试验均为法氏囊抗原阳性（见图6A、图6B）；免疫组呈现不同程度的保护率，其中C、D 组100%保护，A、B 组分别60%、80%保护（见图7）。

图1：免后不同时间各组ELISA 抗体阳性率

图2：免后不同时间各组ELISA 抗体平均水平（GMT）

图3：免后不同时间各组AGP 抗体阳性率

图4：免后不同时间各组AGP 抗体平均水平（GMT）

图5：试验鸡法氏囊病理变化

图6：试验鸡法氏囊免疫组化检测

图7：不同IBD 疫苗免疫组攻毒保护率

3 讨论

3.1 四种IBD 灭活苗免疫1 日龄SPF 鸡，无论是ELISA 抗体、AGP 抗体还是攻毒保护，都呈现出一致的差异：D 苗最好，C 苗次之，A 苗、B 苗较差。这为选择疫苗提供了一定的参考依据。各疫苗存在的这种差异，可能与疫苗中IBDV 抗原的含量不同相关，也可能与疫苗保存运输的过程相关。

3.2 IBD 疫苗所产生的ELISA 抗体水平还是AGP 抗体水平，都与IBDV 攻毒保护呈现正相关，这与文献所报道的IBD 疫苗所产生的AGP 效价与攻毒保护呈正相关的结论是一致的[5]。因此，采用ELISA 和AGP 方法都可以很好的评价IBD 灭活疫苗的免疫效果。