吴 婧,唐晓婷,黄阿妹,房太勇

(福建医科大学附属第二医院消化内科,福建 泉州 362000)

谷氨酰胺连接酶(Glutamate-ammonia ligase,GLUL)又称谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是在大多数物种中发现的一种ATP依赖性酶，能将谷氨酸和氨合成谷氨酰胺，用于保持谷氨酸-谷氨酰胺循环以及氮代谢。GLUL是以ATP依赖性反应催化从谷氨酸和氨合成谷氨酰胺的酶。该蛋白质在氨和谷氨酸解毒、酸-碱稳态、细胞信号传导和细胞增殖中起作用。GLUL的表达与肝、肠上皮、视网膜和乳腺等细胞增殖相关。GLUL在肝细胞癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌中上调，可能是一种新的诊断标志物。但该基因在结肠癌中的生物学作用目前尚未报道，尤其与Akt及ERK增殖及侵袭相关信号通路作用不明确。因此，本研究拟探索GLUL如何通过调节Akt/ERK信号途径来促进结肠癌的发生发展。

1 对象及方法

1.1对象 结肠癌细胞SW480购于中国科学院上海细胞库，在37 ℃和5 %的CO2培养条件下含，培养于10 %的DMEM培养基中培养，培养箱中每隔2～3 d传代1次；设计针对GLUL基因的靶向干扰质粒，真核表达质粒pGenesil-1购于上海禾午生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR技术检测GLUL基因转录水平 分别收获对数期生长的SW480细胞、SW480-siGLUL细胞，取5×107个细胞加入1.5 mL离心管中，用枪头吹吸含有1 mL的Trizol液至混匀，室温放置5 min；每管中再加入0.2 mL氯仿，充分颠倒混匀，12 000 g转速4 ℃ 离心5 min；每管再加入1 μL的RNase H，37 ℃反应20 min。GLUL基因引物上游序列5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3',下游序列5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'；β-actin引物上游序列5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游序列5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。

1.2.2Western Blot检测GLUL基因翻译水平 分别收获对数期生长的SW480细胞、SW480-siGLUL细胞，100 μL细胞裂解液加入106个细胞溶液，裂解20 min；12 000 g于4 ℃离心5 min；将上清移至离心管中，-70 ℃保存；……