丁红映 熊兴耀， 王万兴 胡新喜 田宇豪 秦玉芝*

（1 湖南农业大学园艺园林学院，湖南省马铃薯工程技术研究中心，湖南长沙 410128；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业农村部薯类作物生物学与遗传育种重点实验室，北京 100081）

植物对低温的适应性受多基因调控，耐寒性评价从低温胁迫下植物的表型特征、细胞生理生化变化、分子响应等不同层面进行（陈林波，2010；许英 等，2015），常见的评价方法有直接鉴定法和间接鉴定法两类。直接鉴定法包括田间自然霜冻法、生长恢复法、人工气候室法等（李文明 等，2017）。间接鉴定法主要有测定细胞膜电导率、氧化还原酶系统、可溶性糖含量、脯氨酸含量、叶绿素荧光参数以及NBT/DAB组织原位显色等。其中，田间自然霜冻法、测定细胞膜电导率和生理生化指标较为常见。魏亮（2012）采用电导率法和田间自然霜冻法评价了116 份马铃薯材料的耐寒性。杨慧菊和郭华春（2016）通过测定相对电导率、过氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量和可溶性蛋白含量评价了10 个马铃薯品种的耐寒性。

植物耐寒性是数量遗传性状，单一指标难以准确地反映耐寒性的强弱，采用不同分析方法综合衡量，可以增强评价的准确性（杨慧菊和郭华春，2016）。应用不同分析方法综合评价植物的逆境耐受性已有诸多报道，如采用隶属函数分析和聚类分析相结合的方法评价作物耐盐性（穆志新 等，2017；李青 等，2018；牛远 等，2018；耿雷跃 等，2019）、耐高温性（曾小玲 等，2010；朱朝辉 等，2011；韩瑞宏 等，2015；靳路真 等，2016）、抗旱性（谢小玉 等，2013；张庆华 等，2018；孙丰磊 等，2019）、耐低温性（黄超 等，2018）等。

马铃薯喜冷凉但不耐霜冻，中国南方冬闲田是马铃薯“主粮化”目标下开发的重点区域，该区域秋冬作马铃薯在生长期间容易遭受持续低温以及霜冻危害，造成减产或绝收（熊兴耀 等，2008）。利用科学的方法对马铃薯耐寒性进行评价，提高马铃薯耐寒种质筛选的准确性，对于马铃薯耐寒育种研究以及区域生态强适应型品种培育具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试103 份马铃薯材料从中国马铃薯资源库、黑龙江省农业科学院克山分院、中国农业科学院蔬菜花卉研究所、华中农业大学园艺林学学院、国际马铃薯中心（CIP）亚太中心（中国）、美国威斯康星州马铃薯种质库（USDA）等单位引进，材料编号、名称、来源及选育区域详见表1。

表1 供试马铃薯材料的编号、名称、来源及选育区域

续表

1.2 试验方法

1.2.1 电导率法 2018 年9 月初在湖南农业大学马铃薯工程中心组培室进行组培苗扩繁，每份材料5 瓶，每瓶5～6 株，光照强度为3 200 lx，光周期为14 h/10 h（光照/黑暗，下同），温度为20～22 ℃，生长25 d 后移栽于人工气候室，光照强度为5 500 lx，光周期为14 h/10 h，温度为20～22 ℃，生长50 d 后取功能叶片（以倒数第3、4 节位的叶片最佳）1～2 片测定电导率。

电导率的测定参照李飞等（2008）的方法略作改动：将功能叶片用蒸馏水反复冲洗并吸干叶片表面水分，放入50 mL 带盖的离心管中，封口后置于程序降温仪内，初始温度为0 ℃，保持30 min，在离心管底部加入少许冰块，继续保持30 min 后，温度由0 ℃降至-1 ℃，处理1 h 后取样，温度由-1℃降至-2 ℃，处理1 h 后取样，以此类推，直至温度降至-7 ℃。每次取样后，将离心管放在冰上解冻；将解冻叶片剪成1.5 mm 左右的条形，尽量避开主脉，称取0.1 g，加入10 mL 去离子水，充分浸泡，设3 次重复。12 h 后摇匀，测定电导率R1，在100℃水浴锅中煮沸20 min，冷却至室温，摇匀，测定电导率R2。电解质渗出率=R1/R2×100%，求出3 次电解质渗透率的平均值，用Logistic 方程拟合。电解质渗透率与低温处理温度之间遵循Logistic 方程的变化规律，用曲线拐点表示各马铃薯品种的半致死温度（丁旭 等，2017）。

1.2.2 田间自然霜冻法 2018 年10 月10 日在湖南农业大学马铃薯工程中心组培室进行组培苗扩繁，每份材料5 瓶，每瓶5～6 株，光照强度为3 200 lx，光周期为14 h/10 h，温度为20～22 ℃，生长30 d 后于11 月10 日移栽至室外，每份材料种植3盆，每盆4～5 株，3 次重复。2018 年12 月中旬至2019 年1 月中旬，湖南长沙地区霜冻和冰雪等寒冷天气符合马铃薯生长期间自然霜冻评价条件。

田间自然霜冻法根据叶片的颜色、水渍斑以及茎秆的透明度来评价植物的抗冻性，植物受冻害程度越低，说明耐寒性越强（李文明 等，2017）。Vega 和Bamberg（1995）、Chen 等（1999）将植物的冻害情况划分为7 个等级：0 级，没有损伤；1 级，顶叶受到轻微伤害；2 级，顶叶少部分冻死；3 级，大多数顶叶冻死；4 级，所有顶叶及叶柄冻死；5 级，所有叶片冻死；6 级，整株冻死。

1.3 主要仪器

试验用仪器包括程序降温仪、DDSJ-308A 型电导率仪、天平、50 mL 离心管、水浴锅等。

1.4 数据统计分析

数据处理采用Microsoft Excel 2010 软件，聚类分析、半致死温度计算采用SPSS 22.0 软件。

1.4.1 隶属函数分析 耐寒系数和隶属函数计算参考谢季坚和刘承平（2005）、杨金红（2007）的方法。

耐寒系数=处理测量值/对照测量值×100% ①

隶属函数值u（Xij）=（Xij-Xmin）/（Xmax-Xmin） ②

反隶属函数值u（Xij）=1-（Xij-Xmin）/（Xmax-Xmin） ③

其中，u（Xij）为第i个品种第j个指标的隶属函数值，Xij为耐寒系数，Xmin为所有供试材料中第j个指标耐寒系数的最小值，Xmax为所有供试材料中第j个指标耐寒系数的最大值。如果耐寒指标与耐寒程度呈正相关，用公式②计算，反之用公式③计算。

1.4.2 耐寒性鉴定标准 采用隶属函数法对试验材料进行耐寒性排序，隶属函数度参考张文娥等（2007）的方法。0.70≤u（Xij）≤1.00 为高耐，划为Ⅰ级；0.60≤u（Xij）≤0.69 为耐寒，划为Ⅱ级；0.40≤u（Xij）≤0.59 为中耐，划为Ⅲ级；0.30≤u（Xij）≤0.39 为低耐，划为Ⅳ级；0≤u（Xij）≤0.29 为不耐，划为Ⅴ级。

2 结果与分析

2.1 103 份马铃薯种质资源耐寒性隶属函数法评价结果

2018 年12 月28 日至2019 年1 月3 日，湖南长沙地区遭遇连续6 d 低温天气，最低温度在0 ℃以下，形成了很好的自然霜冻评价条件。12 月31日至翌年1 月1 日降雪，待雪融化后，1 月3 日对103 份马铃薯种质资源耐寒性进行田间自然霜冻法评价（图1）。随着气温的恢复，1 月20 日再次统计了马铃薯种质资源的耐寒等级，与1 月3 日的结果基本一致。

图1 田间自然霜冻条件下部分马铃薯种质资源的耐寒性评价

根据公式③和1.5.2 的耐寒性鉴定标准，采用隶属函数法对半致死温度和霜冻表型分级的两个指标进行分析。如表2 所示，半致死温度隶属函数值划分为Ⅰ级〔0.7≤u（Xij）≤1.0〕的有16 份材料，属于高耐，占供试材料的15.5%；Ⅱ级〔0.60≤u（Xij）≤0.69〕有6 份材料，属于耐寒，占供试材料的5.8%；Ⅲ级〔0.40≤u（Xij）≤0.59〕有39份材料，属于中耐，占供试材料的37.9%；Ⅳ级〔0.30≤u（Xij）≤0.49〕有21 份材料，属于低耐，占供试材料的20.4%；Ⅴ级〔0≤u（Xij）≤0.29〕有21 份材料，属于不耐，占供试材料的20.4%。

霜冻表型分级隶属函数值划分为Ⅰ级的有17份材料，属于高耐，占供试材料的16.5%；Ⅱ级有8 份材料，属于耐寒，占供试材料的7.8%；Ⅲ级有20 份材料，属于中耐，占供试材料的19.4%；Ⅳ级有10 份材料，属于低耐，占供试材料的9.7%；Ⅴ级有48 份材料，属于不耐，占供试材料的46.6%。

表2 103 份马铃薯种质资源耐寒性隶属函数法评价结果

续表

通过上述分析，采用电导率法和田间自然霜冻法评价的隶属函数值为Ⅰ级（高耐）的分别占15.5%和16.5%，两者仅相差1 个百分点，Ⅱ级（耐寒）分别占5.8%和7.8%，两者相差2.0 个百分点，但是Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ级的占比差异较大。电导率法的Ⅲ级（中耐）、Ⅳ级（低耐）、Ⅴ级（不耐）占比分别为37.9%、20.4%、20.4%；而田间自然霜冻法分别为19.4%、9.7%、46.6%，Ⅴ级（不耐）占比扩大，其他等级的比例缩小。产生这种现象的原因可能是在田间自然霜冻法评价的过程中，温度和时间无法人为控制，持续的低温胁迫将大多数中间抗性材料归为Ⅴ级，即耐寒性最差的一类。

2.2 103 份马铃薯种质资源耐寒性聚类分析结果

将103 份马铃薯材料的半致死温度进行聚类分析（表3、图2），得到58 份不耐寒和低耐寒材料，占供试材料的56.3%；29 份中耐寒材料，占供试材料的28.2%；16 份耐寒和高耐寒材料，占供试材料的15.5%。霜冻表型分级聚类分析（表3、图3）得到61 份不耐寒和低耐寒材料，占供试材料的59.2%；19 份中耐寒材料，占供试材料的18.4%；23 份耐寒和高耐寒材料，占供试材料的22.3%。电导率拟合方程分析材料的半致死温度（LT50）与霜冻表型分级结果呈极显著正相关，相关系数为0.747，表明电导率法鉴定的结果真实可信，与马铃薯材料在田间低温霜冻环境下存活情况高度一致。两种方法的聚类分析结果相差不大，但是从品种来看，华恩1 号（半致死温度聚类为1 类，霜冻表型分级聚类为3 类）、中薯17 号（半致死温度聚类为1 类，霜冻表型分级聚类为3 类）的跨度较大，其他材料的聚类跨度较小。

表3 103 份马铃薯种质资源耐寒性聚类分析结果

图2 半致死温度聚类分析

图3 霜冻表型分级聚类分析

2.3 不同来源的马铃薯种质资源耐寒性比较

采用隶属函数法和聚类分析法比较103 份不同来源的马铃薯种质资源的耐寒性，如表4 所示，隶属函数法的鉴定结果是，采用半致死温度和霜冻表型分级评价的中等以上耐寒性资源分别占供试材料的21.36%和24.27%，国外引入材料分别占28.13%和28.13%，国内材料分别占18.31%和22.54%；中等耐寒性资源分别占供试材料的37.86%和19.42%，国外引入材料分别占40.63%和31.25%，国内材料分别占36.43%和14.08%；敏感资源分别占供试材料的40.78%和56.31%，国外引入材料分别占31.25%和40.62%，国内材料分别占45.07%和63.38%。

聚类分析法的鉴定结果是，采用半致死温度和霜冻表型分级评价的1 类资源分别占供试材料的56.31%和59.22%，国外引入材料分别占43.75%和43.75%，国内材料分别占61.97%和66.22%。2类资源分别占供试材料的28.16%和18.45%，国外引入材料分别占34.37%和28.13%，国内材料分别占25.35%和14.08%。3 类资源分别占供试材料的15.53%和22.33%，国外引入材料分别占21.88%和28.13%，国内材料分别占12.68%和19.72%。

表4 103 份不同来源的马铃薯种质资源耐寒性比较

隶属函数法和聚类分析法的结果均表明国外引入种质资源的耐寒性强于国内，国内种质资源中北方一作区的耐寒性强于西南混合区。湖南马铃薯工程技术研究中心以耐低温性强为目标引入国外材料是国外材料耐寒性整体偏高的主要原因；另外，北方一作区为我国马铃薯主产区，选育的马铃薯品种类型丰富，适应性广，因此从优势区域引进马铃薯资源，进行冬作生态环境强适应型品种筛选始终是南方马铃薯产业发展的有效措施。

3 讨论与结论

马铃薯作为世界范围内主要的粮食作物之一，在我国农业生产中具有重要的地位。目前在马铃薯普通栽培种中没有发现耐寒性较好的资源，但野生种在长期的进化和适应过程中产生了诸多的变异类型，形成了抗逆性强特异品种性状丰富等特点，所以对包括野生种在内的耐寒种质资源进行挖掘，是拓展马铃薯抗性遗传背景的有效手段（康黎，2017）。国际上马铃薯耐寒性研究起步较早，电导率分析法和田间自然霜冻法也是国内外学者普遍使用的方法。电导率法技术完善，不受季节的限制，应用较广泛，在猕猴桃（杨超英 等，2014）、小麦（赵瑞玲 等，2019）、樱桃（任惠 等，2016）等抗寒性研究中取得较好效果，但是该方法操作繁琐，周期长，对测试叶片的生长一致性要求高，重复性不好，大批量材料的筛选受到限制（魏亮，2012）。田间自然霜冻法的分级细致合理，结果可靠，适合大批量的供试材料筛选，但该方法周期性长，受季节的限制，冰（霜）冻程度和时间不可控制。另外，采用单一指标很难用于机理十分复杂的耐寒性分析，本试验在测定2 个指标的基础上，引入科学的分析方法，为综合评价马铃薯耐寒性资源提供了新的思路。

本试验采用电导率法和田间自然霜冻法的两个指标，综合隶属函数分析法和聚类分析法评价了103 份马铃薯资源的耐寒性。结果发现，马铃薯普通栽培种具有一定耐寒性的大多数材料半致死温度在-2.11～-0.72 ℃之间（半致死温度聚类在第1类，材料58 份，占比56.3%），田间自然霜冻评价等级在3.8～6.0 级之间（霜冻表型分级聚类在第1类，材料61 份，占比59.2%），本试验对马铃薯普通栽培种的耐寒性分级与前人的研究结果一致（魏亮 等，2017）。隶属函数法对田间自然霜冻等级评价的中等以上耐寒材料、中等耐寒材料、敏感材料所占比例分别是24.27%、19.42%、56.31%，而聚类分析法对田间自然霜冻等级评价的3 类、2 类、1 类所占比例分别是22.33%、18.45%、59.22%，两种方法差值的绝对值分别是0.97%、0.97%、2.91%，说明半致死温度和霜冻表型分级鉴定结合隶属函数法和聚类分析法能够有效评价马铃薯种质资源的耐寒性。

综合电导率法和田间自然霜冻法评价结果，本试验得到Anti-10、陇薯5 号、Sten-1、中薯10 号、389746.2、龙薯4 号、Lxs-4、l0004-12、中薯12号、春薯1 号、冀张14 号、中薯170 号、Vio-9、红美、中薯4 号、10-14、01-44、新大坪、中薯8 号、中薯3 号、GS397 等21 份不耐寒材料，半致死温度在-1.58～-0.72 ℃之间，评价等级为4～6 级。同时得到Funday、AV9、BS214、396034.268、狗头山药、临薯3 号、乌蒙684、康薯53、CBADG-16X、河坝洋芋、ФИΤΟФΤΟΡΟy СΤΟЙЧИВЫЙ、中薯2 号、F170 F171、acancle-4、CBADG-13X、GS393 等16 份耐寒性较好的材料，半致死温度在-3.80～-2.90 ℃之间，霜冻表型分级为0.20～2.00级，其中，GS393 耐寒性最强，半致死温度为-3.8℃，霜冻表型分级为0.20 级。