邱正明 严承欢* 黄 燕 刘志雄 朱凤娟 吴金平 郭凤领

（1 湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北武汉 430064；2 华中农业大学园艺林学学院，湖北武汉 430070；3 蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，湖北武汉 430064）

莴苣（Lactuca sativa，2n=18）属于菊科莴苣属，在世界范围内广泛种植（Coria-Cayupan &Pinto，2009）。全球的莴苣栽培面积已达122 万hm2，总产量约2 678 万t，其中超过50%的栽培面积和产量均来自中国（http：//www.fao.org/faostat/en/）。莴苣经济价值较高，仅2015 年美国的叶用莴苣（生菜）产值已达30 亿美元，且该数值逐年增加（Wells et al.，2016）。根据表型差异，可以将莴苣分为6 种栽培类型：结球生菜、奶油生菜、散叶生菜、罗马生菜、莴笋以及油用莴苣（Zhang et al.，2017）；根据是否含有花青素，可以将莴苣分为紫色莴苣和绿色莴苣。除结球生菜以外，其他5 种莴苣栽培类型均含有紫色品种。紫色莴苣因其颜色艳丽，富含花青素，具有一定的抗氧化、降低血压、预防癌症等功效，逐渐受到人们的青睐，如紫冠、紫罗马、紫翠等紫色莴苣品种。莴苣中花青素主要类型为矢车菊素，不同莴苣品种花青素含量差异显著（Kim et al.，2016）。本文拟通过阐述近年来莴苣花青素生物合成与调控领域的重要研究进展，阐明莴苣花青素的生物合成与调控途径，以及影响莴苣花青素形成的主要环境因素，为开发富含花青素的莴苣功能性食品提供参考依据。

1 植物花青素的化学结构及种类

花青素（anthocyanins）是植物中最大的一类水溶性类黄酮化合物，广泛分布于植物界中（Tohge et al.，2013）。花青素的基本骨架为C6-C3-C6 结构，根据B 环上取代基的不同而产生不同类型的花青素（吕玲玲 等，2018）。自然界中常见的花青素类型主要有6 种（Zhang et al.，2014），包括矢车菊素（cyanidin）、飞燕草素（delphinidin）、天竺葵素（pelargonidin）、矮牵牛素（petunidin）、芍药素（peonidin）以及锦葵花素（malvidin）（图1）。以上花青素类型中的羟基可以与不同的糖类结合进而产生不同类型的花色苷，莴苣中的花色苷主要是矢车菊素糖苷化后与有机酸结合的产物（Mulabagal et al.，2010）。自然界中已发现的花色苷种类超过600 种，不同类型的花色苷产生的颜色略有差异，矢车菊素及其衍生物主要呈紫色，天竺葵素及其衍生物呈红色，飞燕草素及其衍生物呈蓝色或者紫色（Grotewold，2006）。此外，植物液泡的pH 值也会影响花青素的颜色，当pH 值为1.0～2.0 时，花青素呈红色；当pH 值为6.0～6.5 时，花青素呈蓝色；当pH＞7.0 时，花青素呈浅黄色（Zhang et al.，2014）。在莴苣中，花青素主要呈紫色，因其含量以及叶片背景颜色的差异而形成不同的紫色莴苣品种。不同紫色莴苣品种的叶片花青素含量差异较大，在3.665～1 496.934 nmol·g-1（FW）之间均有分布，一般情况下花青素含量与其组织颜色深浅呈正相关（郝敬虹 等，2014）。

图1 自然界中常见的6 种花青素结构

2 莴苣花青素的生物合成

花青素生物合成途径属于类黄酮合成途径的一个分支，该生物合成途径非常保守，是植物中研究最深入的次生代谢途径之一（Tanaka &Ohmiya，2008）。莴苣花青素的生物合成途径与模式植物拟南芥类似（苏文清，2018），主要分为3 个阶段（图2）。第一阶段为类黄酮合成的共用途径，以苯丙氨酸（phenylalanine）为底物，分别在苯丙氨酸裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酰CoA 连接酶（4CL）的作用下产生4-香豆酰CoA（4-coumaroyl CoA）。第二阶段为类黄酮生物合成的关键阶段，所涉及基因为早期生物合成途径基因（early biosynthetic genes，EBGs）。在查耳酮合成酶（CHS）作用下，1 份4-香豆酰CoA 和3 份丙二酰CoA（malonyl-CoA）产生柚配基查尔酮（naringenin chalcone），在查耳酮异构酶（CHI）作用下转化为柚皮素（naringenin），进一步在黄烷酮3-羟化酶（F3H）的催化下产生二氢山柰酚（dihydrokaempferol），而类黄酮3′-羟化酶（F3′H）和类黄酮3′，5′-羟化酶（F3′5′H）又分别催化二氢山柰酚产生二氢槲皮素（dihydroquercetin）和二氢杨梅素（dihydromyricetin）。第三阶段为花青素合成与修饰阶段，所涉及基因为晚期生物合成途径基因（late biosynthetic genes，LBGs）。在二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）作用下，二氢黄酮醇产生对应的无色花青素，之后在无色花青素双加氧酶/花青素合成酶（LDOX/ANS）作用下分别转化为矢车菊素、天竺葵素和飞燕草素等3 种显色花青素。这些花青素的化学性质并不稳定，需要通过类黄酮糖基转移酶（UFGT）、甲基转移酶、酰基转移酶等修饰后形成化学性质稳定的花色苷产物。此外，在谷胱甘肽S转移酶（GST）等基因的帮助下，修饰过的花色苷被运输到液泡存储（Cheng et al.，2015），在pH值、金属离子等因素的共同作用下植物显现出各种颜色。

图2 莴苣花青素生物合成及调控途径

紫色莴苣材料中，多个EBGs 和LBGs 上调表达，包括CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR和ANS等基因（Zhang et al.，2016）。除上述基因外，在紫色散叶生菜材料中花青素酰基转移酶AT基因显著上调表达（岳贞，2014）。花青素表达调控网络研究结果显示，两个花青素合成途径基因GST和ANS与莴苣花青素积累紧密相关（Zhang et al.，2017），其中LsANS负责无色花青素转化为显色花青素，LsGST控制花色苷向液泡的转运过程。在草莓中鉴定到1 个FaGST基因功能缺失的突变体，其叶柄和果实均不能变为红色（Luo et al.，2018）。类似的，在莴苣中LsANS和LsGST的功能缺失则不能形成紫色莴苣（Su et al.，2019）。花青素组分分析显示，莴苣Cherokee 中花青素主要为矢车菊素-3-O-6′-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷，并且其可以快速转化为矢车菊素-3-O-6′-丙二酰-β-吡喃葡萄糖苷甲酯和矢车菊素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷（Mulabagal et al.，2010），该结果与Su 等（2019）的研究结果一致。以上研究结果表明，在莴苣中F3′5′H 花青素合成分支受到抑制，而F3′H 活性较强，因此莴苣花青素生物合成以矢车菊素分支为主要合成途径。

3 莴苣花青素的转录调控

花青素的生物合成主要受MBW 三元复合体调 控，包 括MYB、bHLH 以 及WD40 等3 类 转录因子（Ramsay &Glover，2005），其中MYB 和bHLH 转录因子与DNA 结合激活目的基因表达，而WD40 主要作为载体稳定复合体结构（图2）。根据MYB 转录因子上R 基序的不同可以将其分为多种类型，其中参与花青素激活的MYB 转录因子主要为R2R3-MYB，如PAP1、PAP2 和MYB12 等（Stracke et al.，2001），而抑制花青素生物合成的MYB 转录因子为R3-MYB 和部分R2R3-MYB，如CPC（Zhu et al.，2009）、MYB27（Albert et al.，2014）等。在拟南芥中，GL3 和EGL3 两个bHLH转录因子均涉及花青素的调控，且存在功能冗余（Zhang et al.，2003）。此外，WD40 作为MBW 三元复合体的载体，也是花青素合成的重要调控因子，如TTG1（Walker et al.，1999）等。

转录组分析显示，在莴苣中MBW 三元复合体转录因子促进花青素积累，如MYB12、MYB75、MYB90、EGL1、TTG1 等（Zhang et al.，2016）。与通常的R2R3-MYB 转录因子激活花青素生物合成不同，1 个R2R3-MYB 转录因子AtMYB60 可以抑制莴苣花青素的积累（Park et al.，2008）。Zhang等（2017）利用RNA-seq 测序技术，对全世界范围内的240 份莴苣栽培种及野生材料进行测序，采用GWAS（genome-wide association study）分析发现多个转录因子调控莴苣花青素的积累，包括MYB113（LG5_426271）、bHLH42（LG5_467062）等。Su 等（2019）研究表明，莴苣花青素生物合成受多个转录因子（≥4 个）控制（图3），包括RLL1（bHLH）、RLL2（R2R3-MYB）、RLL3（R3-MYB）和RLL4（WD40）。这些转录因子中，bHLH 和R2R3-MYB 为正调控因子，而R3-MYB和WD40 为负调控因子。当R2R3-MYB 转录因子处于激活状态，则促进花青素积累，产生紫叶莴苣；而bHLH 功能缺失时，导致花青素生物合成途径被阻断，产生绿叶莴苣。此外，当R3-MYB 和WD40 发生变异时，其对花青素生物合成途径的抑制作用解除，进而产生浅紫/紫叶莴苣（图3）。值得注意的是，该研究中RLL4（WD40）虽然为AtRUP1/AtRUP2 的同源体，但其并不通过MBW三元复合体途径对花青素的积累产生影响，因此在莴苣中RLL4 可能存在一个与拟南芥不同的调控花青素生物合成的机制。

4 莴苣花青素合成的影响因素

除遗传因素外，多种环境因子均影响花青素的生物合成，如光照、温度、土壤pH、肥力等（Winkel-Shirley，2001；Gould，2004）。对莴苣而言，光照和温度是影响其花青素生物合成最重要的环境因子。

4.1 光照

光照是影响莴苣花青素生物合成最重要的环境因子，有无光照直接影响花青素的合成与否。Zhang 等（2018）研究表明，光密度增加可以显著增加莴苣花青素的积累。除光强对花青素的有无起决定作用外，光质也是莴苣花青素生物合成的重要影响因素。莴苣花青素积累依赖UV-B（280～315 nm）途径，通过照射UV-B 可使花青素生物合成基因CHS、F3H、DFR等上调表达，进而产生紫色莴苣（Park et al.，2007）。此外，蓝光（440 nm）也可以极大地促进花青素的生物合成，进而形成紫色莴苣（Stutte et al.，2009）。研究表明，光照对花青素生物合成的影响主要存在两种方式：一是通过泛素化降解途径，COP1 蛋白与MYB基因互作，调控MYB基因对光照的感知；二是直接作用于转录因子，如HY5、MYB等基因启动子上的光响应元件，进而调控花青素的生物合成（黄鼎，2018）。

图3 莴苣花青素调控示意图及其对应表型

4.2 温度

一般认为，温度是影响莴苣花青素生物合成的另一个重要环境因子。一定范围内的低温可以促进莴苣花青素的生物合成，温度过低或者过高均不利于花青素的积累，并且夜间低温可以减缓高温对莴苣花青素积累的影响（Gazula et al.，2005）。在较低温度〔20 ℃/13 ℃（昼/夜），下同〕条件下，莴苣花青素积累量较高，但随着温度升高（30 ℃/25℃）花青素含量显著降低（Boo et al.，2011）。低温是如何诱导莴苣花青素积累的分子机制还有待进一步研究。

4.3 其他

除光照和温度外，水分、CO2浓度等因素均影响莴苣花青素的生物合成。水分缺乏有利于促进莴苣花青素的积累，增强莴苣的抗氧化能力（Baslam &Goicoechea，2012）。高浓度的CO2（1 000 μmol·mol-1）可显著增加莴苣花青素的生物合成，促进花青素的积累（Park et al.，2013）。此外，有报道显示外源喷施一定浓度的硒（0～8 μmol·L-1），可显著增加莴苣花青素的积累（Liu et al.，2017），其作用机制还需进一步研究。

5 展望

随着2017 年莴苣全基因组数据的公布，表明莴苣的研究已进入功能基因组学时代（Reyes-Chin-Wo et al.，2017）。高质量的基因组图谱为深入解析莴苣花青素积累的分子机制奠定了坚实的基础。目前，虽然莴苣花青素的遗传学及功能研究取得了长足进步，但还有多个问题值得深入研究：①鉴定新的调控莴苣花青素积累的转录因子；②莴苣花青素依赖UV-B 途径积累的分子机制；③光质影响莴苣花青素积累的分子机制；④莴苣花青素的修饰、转运和降解机制等。莴苣花青素积累的遗传与分子机制的解析，有助于深入了解莴苣中花青素的代谢过程，有利于未来通过聚合育种、人工定向诱变和基因编辑等技术培育富含花青素的紫色莴苣新材料。将紫色莴苣开发为富含花青素的功能性食品，结合植物工厂生产模式（贺冬仙，2018），可为莴苣未来的产业发展提供新路径。