李志国，宗学醒，闫清泉，王 乐，李玲玉，刘 豪，边燕飞

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500）

世界上有1 000多种奶酪，法国约500 种，最早生产奶酪的意大利有300 种。奶酪的颜色、口感和香味各不相同。例如：未成熟切达奶酪风味温和，随着熟化风味变得强烈；成熟的切达奶酪风味曾被描述为“牛肉味”或“肉汤味”；高达奶酪为黄油味、坚果味，随着成熟变为焦糖或奶油糖果的味道，但不强烈；小孔瑞士奶酪为奶油风味，温和、细腻、略带甜味[1]。本文通过阐述及归纳奶酪风味的形成过程，为奶酪风味研究提供理论参考。

1 奶酪风味研究进展

奶酪风味理论研究目前为2 个阶段：第1阶段，最初认为奶酪风味仅由单一的化合物或几种化合物组合而成；第2阶段，20世纪50年代的“组分平衡理论”认为，风味物质的形成是奶酪化合物组分平衡的结果[2]。奶酪风味物质产生的原因是原料乳中的风味化合物及加工处理时乳成分在酶及微生物代谢时产生的代谢物质，包括酸、醇、脂、内酯、醛、酮、酚、醚等多类有机化合物。例如：切达干酪中所含挥发性风味物质已超过100 种，最重要的有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、硫化氢、谷氨酸、甲硫醇及羰基化合物以及非挥发性化合物，如多肽、短肽及游离氨基酸[3]。

风味研究的最新技术为H S-S P M E-G C-M SGC-O，即采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术和气相色谱-嗅觉测量方法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）对奶酪风味物质的化学成分进行分析[4]。

2 奶酪风味物质形成机理

奶酪风味物质的形成是一个复杂和多化学反应的过程，不仅有化学反应，还包括菌种内部的生化反应，其过程主要包括4 个经典反应：酪蛋白的酶解、脂肪脂解、乳糖的糖酵解以及柠檬酸代谢[5]。菌种可分为发酵菌种和非发酵菌种，发酵菌种中最主要的产酶菌包括乳酸乳球菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌以及明串珠菌。非发酵菌种中，瑞士奶酪中使用丙酸菌，在一些表面熟化奶酪中使用不同好氧菌，如短杆菌、葡萄糖球菌和青霉菌等。关于酶的来源，包括：牛乳中的固有酶，如血纤维蛋白溶酶和脂解酶；牛乳中的添加酶，如凝乳酶；发酵剂产生的酶；微生物产生的酶，如霉菌和表面裂缝中微生物产生的酶以及在细胞死亡或脂解后微生物中释放的酶。

2.1 原料乳组分和凝乳酶的作用

原料乳的主要成分为水、蛋白质、脂肪、乳糖及矿物质等，其中酪蛋白含量约占总蛋白含量的80%，多组分的混合体系是影响奶酪风味的重要前体物质。凝乳酶是传统奶酪制造中最主要的蛋白酶，主要来源于胃内产生的一种天冬氨酸蛋白酶，酶解底物主要是生牛乳中的κ-酪蛋白，对β-酪蛋白和αs1-酪蛋白也可发生作用，其易发生断裂的肽键分别为Phe105-Met106、Leu192-Tys193和Phe23-Phe24，它们对底物反应专一性能力的顺序为κ-酪蛋白＞β-酪蛋白＞αs1-酪蛋白。在凝乳酶作用下，κ-酪蛋白中Phe105-Met106间的肽键最易发生断裂，αs1-酪蛋白中Phe23-Phe24间的肽键最不容易发生断裂[6]，断裂位置和程度不同的产物将会作为蛋白酶分解的前体物质。

2.2 蛋白质水解

蛋白质的水解较为复杂，但也是奶酪成熟中最重要的生化反应。由于牛乳中游离氨基酸含量很低，发酵剂菌种在牛乳中生长很大程度上依赖它们的蛋白质水解反应，生成多肽、短肽和氨基酸。奶酪中的蛋白质水解物来源于5 部分：牛乳中天然酶、凝乳酶、发酵剂、二级发酵剂和非发酵剂微生物[7]。

蛋白质酶解的基本机理和顺序、大部分熟化奶酪中蛋白质水解的一般过程如下：首先，初始的酪蛋白水解主要是由于牛乳中天然酶类（如血纤维蛋白酶、组织蛋白酶D等）的作用，但水解程度较小；其次，奶酪制作过程中的凝乳酶作用使得酪蛋白于酶切割位点处裂解成缩氨酸、多肽等；最后，大分子、中等大小的缩氨酸（2～50 个氨基酸连接的构造物，表现出不同于蛋白质的活性和机能，一般为蛋白质的一种或蛋白质的短片）在发酵剂和非发酵剂酶的作用下降解为小分子缩氨酸和游离氨基酸[8]。

发酵剂蛋白酶和肽酶的主要作用机理如下：首先，添加的凝乳酶和天然存在于牛乳中的血纤维蛋白酶生成分子质量较大和中等的缩氨酸，其分子质量较大，对奶酪风味产生的影响较小；其次，发酵剂代谢生成的蛋白酶和肽酶作用于缩氨酸，生成短链缩氨酸和氨基酸。对于奶酪成熟的关键以及蛋白质风味的释放，需要进一步研究发酵剂如何及何时代谢生成酶类以及酶的种类。目前已经从奶酪成熟期中分离出几种酶类和肽酶，Detmers等[9]描述了丙氨酸菌ATCC9617的脯氨酸亚基肽酶（proline iminopeptidase，pip），分离了pip基因与核苷酸序列，并在大肠杆菌中表达该基因，将其复制到乳酸链球菌的染色体中，证实pip是形成瑞士型奶酪甜味的因素，在奶酪成熟过程中具有去除苦味作用。

非发酵剂酶的作用机理为表面成熟奶酪中的微生物菌群，如霉菌、微球菌和牛棒状杆菌代谢生成的酶类由外表面向内部不断裂解奶酪，形成风味。例如：著名的卡芒贝尔（Camembert）奶酪就是利用霉菌进行熟化处理，它的表面覆盖着一层白色霉菌[10]。发酵过程中，白色霉菌产生的酶将蛋白质分解为氨基酸，由于这种霉菌在无氧条件下无法进行生长繁殖，因此奶酪内部没有此类霉菌。随着霉菌繁殖，奶酪也由外向内逐渐成熟、慢慢变软，直到内部的组织结构变软后即可食用。

中等大小的缩氨酸分子并不是影响奶酪风味的主要物质，尽管它们存在于一些奶酪（如瑞士奶酪）中，能够产生肉汤风味。风味物质很多是由短链肽、小分子肽以及游离氨基酸形成的。其中游离氨基酸中，芳香族氨基酸和支链氨基酸对风味的影响较大。芳香族氨基酸是花香物质和酚香物质，Gao等[11]对乳球乳酪菌NCDO763中芳香转氨酶的生物化学特性进行分析，发现该酶启动了亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸的生成，它们都是奶酪风味物质。奶酪成熟过程中还有一些不良风味的产生，如奶酪中存在的苦味肽。苦味形成的机理如下：蛋白质水解后，肽链中含有的疏水性氨基酸或短肽游离出来，接触味蕾产生苦味；苦味程度与苦味氨基酸产生的苦味阈值有关，阈值越低，苦味程度越强。苦味肽含有1 个或多个疏水性氨基酸，如亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸等，这些氨基酸一般位于肽链末端。组氨酸的阈值为20 mg/100 mL，缬氨酸为150 mg/100 mL，色氨酸为90 mg/100 mL[12]。苦味与肽链中氨基酸的排列顺序有关，在其羧基末端含有芳香族及支链氨基酸时，苦味增强。

2.3 氨基酸分解代谢

氨基酸的分解代谢产物较多，包括氨、胺、乙醛、苯酚、吲哚和乙醇，其物质的平衡状态影响奶酪最终风味，现已确定多数途径在乳酸链球菌中进行[13-14]。氨基酸是奶酪中不同挥发性风味物质重要的前体物质[15-16]，在脱氨酶、脱羧酶、转氨酶和裂解酶的作用下，它们可以通过不同途径转化。例如：氨基酸转氨形成α-酮酸，其脱羧转化为乙醛，接着脱氢形成乙醇或羧酸，这类成分多数具有香味且对乳制品的整体风味有益。Cefoperazone奶酪风味由乳酸乳球菌乳脂亚种B78细胞提取物L-蛋氨酸形成，此外，来自细胞中的L-蛋氨酸酶加速了奶酪风味的形成[17]。

支链氨基酸和芳香氨基酸的酶解在奶酪风味形成中具有重要作用，它们是奶酪风味物质的前体，如异戊酸（前体为亮氨酸）、异丁酸（缬氨酸）、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和2-甲基丙醛，是各种不同类型奶酪的风味化合物。支链氨基酸和芳香氨基酸被发酵剂乳球菌降解的第1步是转氨，该反应由支链转氨酶和芳香转氨酶催化，且需要α-酮酸作为氨基的接受体。芳香氨基酸转氨酶能转化芳香氨基酸、亮氨酸和蛋氨酸，而支链氨基酸转氨酶能转化亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，也可以转化蛋氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸[18]。

2.4 脂肪酸酶解

脂肪对奶酪风味的形成十分重要。牛乳脂肪是奶酪中的主要脂类，在一些奶酪品种中分解程度较高。如Italian奶酪，其中的脂肪彻底分解为氨基酸，形成风味。对于蓝纹奶酪，游离脂肪酸也是第二大主要风味物质甲基酮形成的底物[19]。在Cefoperazone奶酪中添加食品级解脂酶，促进了游离脂肪酸的分解，有助于形成特殊的风味物质。当游离脂肪酸高于正常水平时，将会破坏风味的平衡，奶酪中正常的游离脂肪酸含量为0.3～100.0 mg/L[20]。奶酪中的游离脂肪酸易发生酯化作用，短链脂肪酸和甲硫醇生成甲硫酯，赋予奶酪特有的芳香气味[21]。奶酪中脂肪酸组分与所使用的脂酶（包括微生物脂酶）特异性有关，不同脂酶对链长不同的脂肪酸高度专一性有所差别。随着成熟期变化，不同奶酪中游离脂肪酸含量差距也很大，鲜乳中游离脂肪酸含量约为415 mg/kg，切达干酪中可达1 793 mg/kg，蓝纹奶酪中为2 500 mg/kg。

奶酪脂肪酶的来源为生牛乳、凝乳酶、发酵剂和非发酵菌。生牛乳中含有专一性显著的脂蛋白脂肪酶，可以对甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯的1～3位进行酶解，生成脂肪酸，其中，在1位上分解得到的为甘油三酸酯。

奶酪中游离脂肪酸的代谢步骤：脂肪酶酶解脂肪，生成游离脂肪酸；游离脂肪酸氧化为β-酮酸；β-酮酸去羰基，生成少1 个碳原子的甲基酮；甲基酮在还原剂作用下生成相应甲基醛。甲基酮的浓度和脂解程度直接相关[22]。

内酯和丁酸是游离脂肪酸的代谢产物。内酯是一种环状酯，是醇酸通过失水进行分子间的酯酸化形成的一种环状结构。α内酯和β内酯不稳定，在有机物的合成过程中作为中间代谢产物；δ内酯和γ内酯比较稳定，不容易发生分解。内酯具有很强的芳香气味，虽然这些芳香物质并不是真正的奶酪风味，但与奶酪风味有一定关系[23]。丁酸是Romano和Provolone奶酪中很重要的风味物质，瑞士硬质奶酪的主要脂肪特征风味是丙酸赋予的[24]。

霉菌熟化类型奶酪中，游离脂肪酸氧化降解为甲基酮，这是蓝纹奶酪中基本的风味物质。蓝纹奶酪的主要特点是制备过程中使用娄地青霉，代谢中产生胞外脂肪酶，继而产生游离脂肪酸。随着游离脂肪酸浓度升高、环境pH值变化，娄地青霉可以将脂肪酸转化为甲基醛，再进一步转化为甲基酮[25]。

2.5 乳糖酵解

未成熟奶酪，如农家奶酪中，乳糖只限于形成强烈的乳酸风味。在成熟奶酪中，乳糖发酵产生的乳酸不仅有抑菌作用，还可降低奶酪中的氧化还原电位和pH值，这一条件有利于酶促反应的缓慢进行，并产生许多风味化合物。

牛乳中大约98%的乳糖于乳清中被排出，剩下一部分残留在奶酪凝块中，乳糖发酵时，风味物质的主要形成途径是乳酸菌的作用，中间体丙酮酸盐的一部分也可以在不同酶的作用下转化成不同的风味物质，如二乙酸、3-羟基-丁酮、乙醛或乙酸，其中一部分化合物可以影响奶酪风味[26]。

发酵剂特性不同，乳糖代谢途径也有差异。一些发酵剂将乳糖代谢成L-乳糖，半乳糖通过糖酵解途径分解为D-乳酸和L-乳酸。通过Leloir途径将半乳糖转化为谷氨酸-6-磷酸，之后进行分解；葡萄糖通过磷酸酮酶途径分解为乳酸、甲醇和

不同奶酪中乳酸含量不同，切达干酪为1.5%，瑞士奶酪为1.4%。切达干酪中的乳酸可以被发酵剂或非发酵乳酸菌氧化，通过一系列反应生成乙酸和CO2，这个反应过程与含氧量关系密切。

2.6 柠檬酸代谢

生牛乳中柠檬酸含量并不高，约为0.2%，但它在一些奶酪中的代谢分解会影响奶酪风味。牛乳中大约90%的柠檬酸可溶于水，随着排乳清过程而排出。引起柠檬酸发酵的微生物主要是肠膜明串珠菌乳脂亚种、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰突变株，它们在牛乳中的最佳生长温度为21 ℃[27]。柠檬酸发酵产生的风味来源于多种化合物，包括双乙酰、丙酸、乙酸和CO2，CO2是荷兰奶酪形成表面孔眼的主要原因。切达干酪含有质量分数大约为0.2%～0.5%的柠檬酸，它的代谢速率取决于保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌及嗜热链球菌等混合发酵剂因素的影响，切达干酪中二乙酸的含量很高，且这些高含量的二乙酸可以影响奶酪风味[28]。二乙酸可以被转化为3-羟基丁酮、2,3-丁烯基乙二醇和2-丁酮，而2-丁酮是奶酪风味物质的主要组成成分。

3 结 语

不同奶酪的风味差异较大，原料乳、菌种发酵过程及加工工艺等的不同均会影响最终风味的差别。把握分析奶酪风味成因的基本原理，将帮助研究人员更好地分析研发及质量等问题。目前，随着气相仪器准确性的提高，对于风味化合物的常用测定方法为HS-SPME-GCMS-GC-O。然而，尚未见有文献对不同奶酪的风味化合物与风味种类的关系进行进一步梳理和归纳，这方面仍需要加强研究。