范海玲　周露丹　梁国安　王丽珍

[摘要] 目的 探讨运动训练对新生鼠在缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后微小RNA210（miR-210）、脑源性神经生长因子（BDNF）和血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 采用Rice-Vannucci法制备新生鼠HIBD模型，分为对照组（C）、假手术组（S）、模型组（M）和运动训练组（T），造模7 d后开始训练1周、2周，取脑组织后采用HE染色观察脑细胞的病理改变，免疫组化法检测脑组织BDNF和VEGF的表达，实时定量荧光PCR检测脑组织miR-210表达水平。 结果 C组和S组大脑组织结构清晰，造模后神经细胞出现变性和坏死。T组和M组在各时间点与S组比较，miR-210、BDNF和VEGF的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。T组和M组中随着时间的延长，miR-210、BDNF和VEGF的表达呈上升趋势，在14 d和21 d后T组和M组比较，上述指标表达差异均有统计学意义（P<0.05）。VEGF表达与miR-210和BDNF呈明显正相关（r=0.841，0.818，P均<0.01）。 結论 运动训练干预新生小鼠缺氧缺血脑损伤可增加miR-210和BDNF的表达，进而促进脑组织VEGF表达，最终对神经损伤起到保护作用。

[关键词] 运动训练;缺氧缺血性脑损伤;微小RNA210;血管内皮生长因子;脑源性神经生长因子

[中图分类号] R722.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）28-0035-05

[Abstract] Objective To investigate the influence of exercise training on the expression of microRNA210（miR-210）， brain-derived nerve growth factor （BDNF） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in neonatal rats after hypoxic-ischemic brain damage （HIBD）. Methods The newborn rat HIBD models were prepared by Rice-Vannucci method and divided into control group （C）， sham operation group （S）， model group （M） and exercise training group （T）. After 7 days of modeling， training was started for 1 week and 2 weeks. After taking brain tissue， the pathological changes of brain cells were observed by HE staining. The expression of BDNF and VEGF in brain tissue was detected by immunohistochemistry. The expression of miR-210 in brain tissue was detected by real-time quantitative fluorescent PCR. Results The brain tissue structure of group C and group S was clear， and the nerve cells showed degeneration and necrosis after modeling. The expressions of miR-210， BDNF and VEGF were significantly different between group T， group M and group S at each time point （P<0.05）. The expressions of miR-210， BDNF and VEGF increased in the T group and M group over time. There were significant differences in the expression of the above indexes between the T and M groups at 14 d and 21 d（P<0.05）. There was a significant positive correlation between VEGF expression and miR-210， BDNF（r=0.841， 0.818， P<0.01）. Conclusion Exercise training intervention in neonatal mice with hypoxic-ischemic brain damage can increase the expression of miR-210 and BDNF， and then promote the expression of VEGF in brain tissue， and finally protect the nerve injury.

[Key words] Exercise training; Hypoxic ischemic brain damage; MicroRNA210; Vascular endothelial growth factor; Brain-derived nerve growth factor

新生儿缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指围产期受各种因素影响而导致的脑损伤，临床会出现脑病的各种表现，遗留多种后遗症，如脑性瘫痪、发育迟缓等。因此寻找各种干预手段是修复缺氧缺血后中枢神经系统（central nervous system，CNS）脑损伤的关键基础之一，目前康复训练是临床研究的热点[1]。既往研究表明运动训练可诱导缺氧缺血脑损伤后的脑血管再生，促进神经元再生[2-3]。本研究探讨运动训练对HIBD新生鼠脑组织微小RNA210（miR-210）、脑源性神经生长因子（brain-derived growth factor，BDNF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 动物来源与分组

入组C57/BL6新生小鼠160只[许可证号：SYXK（浙）2016-0006]，购自温州医科大学动物SPF实验中心，平均體重（3.0±0.5）g，实验动物伦理委员会批准，7日龄时采用Rice-Vannucci法制备新生鼠HIBD模型，随机分为对照组（C，不做任何处理）、假手术组（S，只做颈总动脉分离手术，不结扎，不做缺氧处理）、模型组（M，做缺血缺氧处理）和运动训练组（T，缺血缺氧处理后再做运动训练），造模7 d后开始训练1周、2周，每组8只。

1.2 实验试剂

Trizol试剂盒、内参基因U6（美国Invitrogen公司）;VEGF多克隆抗体（上海研生实业有限公司）;BDNF多克隆抗体（武汉博士德生物工程公司），HE染色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）;辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠二抗（武汉博士德生物工程公司）等。

1.3 实验仪器

日本Shandon公司的石蜡切片机;美国ABI公司的实时定量PCR仪;日本Olympus公司的BX51光学显微镜，美国Media Cybernetics公司的Image ProPlus 6.0彩色医学图像分析系统等。

1.4 模型制备

7日龄小鼠HIBD模型参照经典Rice-Vannucci法[4]进行操作，小鼠仰卧位置于解剖板上，麻醉后在解剖镜下分离出左侧颈总动脉，结扎动脉后再缝合伤口，10 min内完成操作过程。术后2 h将小鼠放入37℃的恒温密闭玻璃瓶内，并输入混合气体（8%氧气和92%氮气），持续1 h后将存活的小鼠送回母鼠身边。S组：只是分离左颈总动脉，而无缺血缺氧处理。

1.5 模型的评估

对新生小鼠进行HIBD处理后，在1 d时观察其3种发育反射：（1）翻正反射：小鼠独自从仰卧位翻成俯卧位，最后至四爪放平，记录整个过程的时间;（2）趋地反射：记录小鼠在斜坡上（倾斜角度为40°）从头朝下运动至扭转身体（90°），同时头朝上时需要的时间;（3）悬崖逃避反射：将小鼠放在高出水平地面1 m的桌面，同时前爪悬挂桌面边缘之外，观察小鼠离开桌面边缘需要的时间（其扭转身体90°）;若后2项反射完成时间超过20 s就剔除。另外模型组小鼠没有出现向右转圈也剔除。

1.6 标本采集

在造模后7 d，14 d，21 d处死小鼠，取出脑组织，放入4%多聚甲醛液定24 h（4℃），之后脱水、石蜡包埋，最后连续冠状切片厚4 μm左右。取脑组织石蜡切片做HE染色，光镜下观察脑组织的病理变化。

1.7 免疫组化染色

取脑组织切片先脱蜡，再灭活内源性酶，PBS冲洗;微波修复抗原10 min，降至室温，再PBS冲洗;滴加VEGF或BDNF多克隆抗体（1：100），4 ℃孵育过夜，复温45 min，PBS冲洗;滴加二抗（山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体），在37℃恒温箱中进行20 min孵育，PBS冲洗干净后使用DAB显色，苏木精复染;阴性对照：用PBS代替一抗。阳性表达为出现棕黄色或褐色颗粒。

1.8 实时荧光定量PCR法检测miR-210的表达

取出脑组织样本，脱蜡处理，按照RNA抽提试剂盒逐步提取总RNA。miR-210特异引物（上游：5-AAGGGCGGCTATGGAAAGGCAA-3，下游：5-AAT-CCACGATGAAGCGGATGCT-3），加入PCR扩增体系中，反应条件：15 s预变性、变性30 s变性，温度均95℃，40 s延伸，温度60℃，循环45次。目的基因表达量用2-ΔΔCt表示，内参基因为U6，所有标本检测3次，最后得出miR-210的相对表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，方差不齐的用Dunnett t3 检验，相关性采用Pearson相关进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIBD小鼠短期神经功能的改变

在小鼠HIBD后1 d时间约80%的小鼠出现向右转圈，发育反射结果提示S组小鼠无明显的神经功能缺损表现，与S组（2.90±0.73）s比较，造模组（3.96±0.55）s完成反射的时间较长，差异有统计学意义（P<0.01），且有神经功能缺损的表现。

2.2 脑组织细胞形态学改变

小鼠脑组织缺血缺氧后1 d，C组和S组脑细胞排列整齐，未见神经细胞变性坏死等明显病理变化。造模后缺血侧脑组织结构模糊，细胞和间质水肿较严重，出现明显空泡化。

2.3 大脑皮层miR-210和BDNF表达

C组和S组小鼠脑组织miR-210和BDNF表达在HIBD后各时间点差异无统计学意义（均P>0.05）;与HIBD后第1天比较，HIBD后第3天、第7天、第14天、第21天，M组miR-210和BDNF表达呈上升趋势;HIBD后各时间点M组miR-210和BDNF表达明显高于C组和S组，差异具有统计学意义（均P<0.05）。T组在第14天、第21天时miR-210和BDNF表达明显高于M组，差异具有统计学意义（均P<0.05），见表1、2、封三图9。

2.4 大脑皮层VEGF蛋白的表达

C组和S组小鼠脑组织VEGF表达在HIBD后各时间点比较，无统计学差异（均P>0.05）;与造模后第1天比较，在第3天、第7天、第14天、第21天时M组VEGF表达呈上升趋势;HIBD后各时间点M组VEGF表达明显高于C组和S组，差异具有统计学意义（均P<0.05）。T组在第14天、第21天时VEGF表达明显高于M组，差异具有统计学意义（均P<0.05），见表3、封三图10。VEGF的表达与miR-210和BDNF的表达呈正相关（r=0.841，0.818 P均<0.01），见图1。

3 讨论

缺氧缺血性脑损伤的病理生理机制较为复杂，HIBD后容易发生细胞凋亡，损伤中枢神经系统多种功能，尤其是认知和运动。因此，减轻缺血缺氧性脑损伤的病理学损害，促进脑血管和神经元再生是改善早期脑功能的关键。在成人的急性脑缺血中，适当的运动训练可改善脑功能，运动训练对HIBD所致的脑瘫患儿的作用机制尚不明确，可能与中枢神经系统的可塑性理论有关，近年来认为涉及到脑血管再生、NSCs的增殖、分化以及迁移等[5]。杨丽君等[6]研究显示在新生鼠进行缺血缺氧处理后对脑组织的神经元和髓鞘造成了一定的损伤，且本研究显示新生鼠HIBD后缺血侧脑组织结构模糊，细胞和间质水肿较严重，出现明显空泡化，所以寻找到阻止未成熟脑的脑损伤进程的方法是目前研究的热点。

VEGF与缺氧缺血性脑损伤的修复机制密不可分，对脑血管的新生有强烈的诱导作用。新生鼠脑组织的可塑性要高于成年鼠，新生鼠在正常生理机制下，血管新生在生后2～3周达到高峰，而在HIBD新生鼠，血管新生持续时间可延迟1周左右[7-8]，因此本研究选取的时间点是造模后1周、2周和3周，结果显示新生鼠HIBD后VEGF的表达在各时间点呈上升趋势，提示脑组织缺血缺氧可以刺激局部血管再生。也有研究发现，在脑缺血再灌注大鼠中，1周的运动训练通过上调内皮型NOS增加了VEGF的表达，4周的运动训练改善了脑功能，可能与上调缺血半暗区脑血管密度的表达有关[9-12];在新生鼠HIBD后2周，早期的环境刺激可减少HIBD所致的认知缺陷，从青春期开始的运动训练直到成年，减少了损伤侧的脑梗死体积，最终改善HIBD所致的学习记忆障碍[13]。本研究结果中运动训练促进了VEGF表达，在血管再生的高峰期，随着时间的延长，表达逐渐上升，尤其在生后1～2周的上升幅度较大，提示早期的康复运动训练在神经损伤修复中占有重要角色。

miR-210为缺氧特异性微小RNA，采集脑卒中患者血浆，研究结果显示血中miR-210表达水平低者提示其预后不佳[14]，对人牙周膜干细胞进行缺氧处理，细胞miR-210表达增加，诱导 VEGF的表达增加[15]，本研究结果显示新生鼠HIBD后miR-210表达呈不断上升趋势，各时间点均高于假手术组，运动训练后miR-210表达更高，miR-210与VEGF表达呈正相关，说明上调且miR-210与血管新生有不可分割的联系。BDNF是一个内源性神经保护因子，BDNF与VEGF关系密切[16-17]，既往研究发现在脑缺血再灌注大鼠中可影响BDNF和VEGF的表达，跑臺运动可增加BDNF表达水平，促进VEGF诱导的血管再生[18-19]。另外，对青少年进行为期2周的运动训练，可引起脑源性神经营养因子的增加和工作记忆的改善，这可能是通过改善脑组织氧合、营养输送和增加BDNF的mRNA表达来实现的[20]。本研究提示BDNF在新生儿HIBD表达与miR-210、VEGF呈同步性，运动训练后明显增加了VEGF、miR-210和BDNF的表达，相关性分析提示VEGF与miR-210和BDNF的表达呈正相关，提示运动训练干预新生小鼠缺氧缺血脑损伤可增加miR-210和BDNF的表达，进而促进脑组织VEGF表达，诱导脑血管再生。

综上所述，在新生鼠HIBD后，我们推测运动训练可能通过调节miR-210/BDNF起到神经损伤的内源性保护作用，为缺血缺氧脑损伤患儿早期开展运动训练为中心的综合康复提供理论依据，最终提高HIBD患儿的生活质量。

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（收稿日期：2019-02-25）