张雪松

[摘要] 目的 探讨该院耐亚胺培南铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的检测方法，并了解该地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的耐药特征，为该院对铜绿假单胞菌的控制提供依据。方法 方便选取65例2017年7月—2018年12月在该院住院治疗的患者的标本，临床分离了65株铜绿假单胞菌，对其进行菌种的鉴定和药物的敏感试验。采用E-test试验对金属酶进行检测，采用PCR法扩增产金属β-内酰胺酶的基因，并进一步测序确认扩增的阳性产物。结果 65株铜绿假单胞菌的标本中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），在分布上呼吸内科、ICU病房比较高，分别占了总数的33.85%（22株）和36.92%（24株）。药敏试验结果显示，有18株（27.69%）铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药，并且大多为多重耐药菌株;E-test试验结果显示，阳性金属酶4株，检出率为22.22%;PCR法扩增金属酶基因阳性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分别为3株和1株。结论 该地区耐亚胺培南的18株銅绿假单胞菌中大多为多重耐药菌株，产金属β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药中发挥着极其重要的作用，并且IMP-1和VIM-2为酶的主要基因型。

[关键词] 亚胺培南;铜绿假单胞菌;产金属β-内酰胺酶;耐药性;基因型;药敏试验;PCR法

[中图分类号] R378.99          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2019）09（c）-0178-03

[Abstract] Objective To investigate the detection method of metallo-β-lactamase produced by imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in the hospital， and to understand the metallo-β-lactamase production by imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in the region. The drug resistance characteristics provide a basis for the control of Pseudomonas aeruginosa in the hospital. Methods A total of 65 specimens of patients hospitalized in the hospital from July 2017 to December 2018 were conveniently selected. 65 strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated and identified for their strains and drug sensitivity tests. The metalloenzyme was detected by the E-test test， and the gene for producing metal β-lactamase was amplified by PCR， and further amplified to confirm the positive product. Results Of the 65 strains of Pseudomonas aeruginosa， the respiratory secretions were the most， accounting for 81.54% （53 strains）. The distribution of upper respiratory medicine and ICU wards was relatively high， accounting for 33.85% （22 strains） and 36.92% （24 strains）. The results of drug susceptibility test showed that 18 strains （27.69%） of Pseudomonas aeruginosa were resistant to imipenem， and most of them were multi-drug resistant strains; E-test test results showed that 4 positive metalloenzymes， detection rate was 22.22%; 3 strains （4.62%） were positive for metalloenzyme gene by PCR， among which IMP-1 and VIM-2 were 3 strains and 1 strain， respectively. Conclusion Most of the 18 strains of Pseudomonas aeruginosa resistant to imipenem in the region are multi-drug resistant strains. The production of metal β-lactamase plays an important role in the resistance of Pseudomonas aeruginosa to imipenem. The role of IMP-1 and VIM-2 is the major genotype of the enzyme.

[Key words] Imipenem; Pseudomonas aeruginosa; Metallo-producing β-lactamase; Drug resistance; Genotype; Drug sensitivity test; PCR method

铜绿假单胞菌（PA）是一种导致院内感染的重要条件致病菌，其会引发菌血症、脑膜炎、院内肺炎、术后伤口感染、泌尿系统感染等病症[1]。而多重耐药的PA由于其耐药范围比较广，并且能够对多种抗生素表现出耐药性，但是临床上对于治疗受到PA感染患者的有效药物却比较少。近年来，随着临床上抗生素的广泛使用，细菌对亚胺培南等药物的耐药率也呈现出了逐年上升的趋势[2]。有研究人员在研究中发现，PA对亚胺培南的耐药率在逐渐下降，而导致PA对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制比较多，如碳青霉烯酶的产生、ESBLs等，而因为产金属β-内酰胺酶（MBLs）导致PA对抗生素耐药的情况也在逐年增加[3]。由于MBLs具有整合子的传播性，随时都可引起MBLs院内感染事件的爆发和流行[4]。该次方便收集了65例2017年7月—2018年12月在该院住院治疗的患者的标本，临床分离了65株铜绿假单胞菌，对其进行菌种的鉴定和药物的敏感试验，并对耐亚胺培南的PA进行了MBLs检测和耐药性分析，进一步了解了该院内亚胺培南耐药PA的特点以及其产生金属酶的情况。现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

方便选取65例在该院住院治疗的患者的标本，临床分离了65株铜绿假单胞菌菌株。

1.2  菌株鉴定以及药敏试验

对其进行菌种的鉴定和药物的敏感试验。采用哥伦比亚琼脂以及相关的鉴定卡片对该次收集到的65株分离菌种进行鉴定。然后采用MH琼脂以及相应的抗生素纸片对65株菌株进行药敏试验。该次试验中判断亚胺培南和美洛培南敏感性的标准为：当最低抑菌浓度≤4 μg/mL时判断为敏感，当最低抑菌浓度=8 μg/mL时判断为中介，当最低抑菌浓度≥16 μg/mL时判断为耐药[5]。该次试验均按照相关的标准要求进行规范化操作，最后对药敏试验的结果进行判读。

1.3  E-test试验

采用E-test试验对金属酶进行检测，取镊子将拭条夹起放在涂布为0.5麦氏单位的亚胺培南耐药菌悬液的琼脂表面上，放在温度为36 ℃的环境下孵育18～24 h，对其结果进行观察。以E-test试验说明书中的相关标准为依据对其结果进行判定：当MIC比值>8时，也就是当EDTA/亚胺培南的MIC下降值≥8倍时，判断为菌株产金属酶[6]。

1.4  PCR扩增试验对MBLs基因型别进行检测

采用核酸提取盒对65株PA的DNA进行提取，设计出检测MBLs编码基因的PCR产物以及相应的反应条件，进行PCR扩增试验。将其送往该市基因科技公司对PA的IMP基因和VIM基因进行测序确认。

2  结果

2.1  PA在该次分离标本中的构成比

65株铜绿假单胞菌的标本中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），其次为脓液7株，占比10.77%，伤口分泌物3株，占比4.62%，其他2株，占比3.08%。

2.2  PA在該院科室中的分布

在分布上呼吸内科、ICU病房比较高，在分布上呼吸内科、ICU病房比较高，分别占了总数的33.85%（22株）和36.92%（24株），其次为急诊、胸外科和骨科。

2.3  PA临床分离菌株对12种药物的耐药率

65株PA对阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南、亚胺培南、美洛培南的耐药率分别为：41.54%、49.23%、50.77%、32.31%、23.07%、36.92%、64.62%、49.23%、24.62%、29.23%，对多粘菌素的敏感率为50.77%。药敏试验结果显示，有18株（27.69%）铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药，并且有16株（88.89%）为多重耐药菌株。这些菌株对氨基糖苷类、头孢类、氟喹诺酮类、碳青霉烯类、含有酶抑制剂的β-内酰胺类等抗菌药物中的3类或者3类以上耐药。18株多重耐药菌株中有8株（44.44%）为广泛耐药菌株，其对除哌拉西林以外的其余11类常用药物的耐药率均为100.00%。18株耐亚胺培南PA的耐药情况比较严重，对临床上12种常用药物中的11种药物的耐药率均超过50.00%。见表1。

2.4  亚胺培南耐药组与敏感组金属酶表型和基因型的检测

65株PA经E-test试验，结果显示，18株亚胺培南耐药组中检出阳性金属酶4株，检出率为22.22%，47株亚胺培南敏感菌株中未检出金属酶阳性菌株。检出率为0.00%。PCR法扩增金属酶基因阳性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分别为3株和1株，其他几种基因型的β-内酰胺酶（如SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM）均未检出。

3  讨论

该次研究中收集了65例2017年7月—2018年12月在该院住院治疗的患者的标本，临床分离了65株铜绿假单胞菌，其中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），分布在上呼吸内科、ICU病房的菌株分别为22株（33.85%）和24株（36.92%）。万强等人[7]在研究中，选取了临床分离的400株铜绿假单胞菌，对其进行菌种鉴定和药物敏感试验，结果显示，400株铜绿假单胞菌中，呼吸道分泌物最多，占比81.50%（326株），分布在上呼吸内科、ICU病房的菌株分别为79株（19.8%）和102株（25.5%）。该次研究结果与万强等人[7]的研究结果是一致的，进一步提示院内呼吸内科和ICU是PA感染的高发区域[8]。对其进行分析后发现，这可能是由于ICU患者免疫力比较低，呼吸内科患者的痰液不容易被排出，增加了患者误吸的几率，同时，呼吸内科患者呼吸机等器械的频繁使用均增加了呼吸道感染的几率[9]。

β-内酰胺类抗菌药物临床应用比较广泛，其包括β-内酰胺类、青霉素类、头孢类、碳青霉烯类等[10]。该次分离的65株PA对哌拉西林、亚胺培南、美洛培南的耐药率分别为23.07%、24.26%和29.23%，因此发现，在该院β-内酰胺类抗菌药物依然是临床治疗PA重症感染患者的首选药物。但是由于临床上对抗生素的不合理使用，导致PA对亚胺培南的耐药率逐渐升高，并且对耐亚胺培南PA菌株的检出率也在逐渐升高，这也给临床治疗带来了较大的困难[11]。该次药敏试验结果显示，有18株铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药，并且大多为多重耐药菌株。提示PA能够对抗广泛的耐药种类，并且其耐药水平还比较高。E-test试验结果显示，18株亚胺培南耐药组中检出阳性金属酶4株，检出率为22.22%，47株亚胺培南敏感菌株中未检出金属酶阳性菌株。检出率为0.00%。该次研究中针对上述基因设计的引物进行了PCR扩增后结果发现，金属酶基因阳性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分别为3株和1株。而其他几种基因型的β-内酰胺酶（如SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM）均未检出，这与Samaneh Shirazi等人[12]的研究结果是一致的。

综上所述，产金属β-内酰胺酶所引起的细菌感染事件的增加和流行敲响了警钟，临床上应加强对抗菌药物的规范使用。该院耐亚胺培南的18株铜绿假单胞菌中大多为多重耐药菌株，产金属β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药中发挥着极其重要的作用，并且IMP-1和VIM-2为酶的主要基因型。临床上应加强对PA耐药性的监测，并加强预防为主，避免长期使用同一种类型的抗菌药物，同时还应加强对病原学的检查，根据药物敏感试验的结果选择正确的抗菌药物，以达到最佳的治疗效果，并做好院内感染的预防和控制。

[参考文献]

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[2]  陈咏君，陈咏玫，张立群，等.亚胺培南耐药铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶基因的流行病学研究[J].中国实验诊断学，2016，20（9）：1471-1474.

[3]  徐荣，谢璟，张聪玲，等.铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶与耐药相关性分析[J].实验与检验医学，2016，34（4）：451-454.

[4]  彭敏颜.佛山地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌临床分离株中产金属β-内酰胺酶流行株的主要基因型和耐药性[J].大家健康：学术版，2015，9（17）：138-139.

[5]  唐慧琴，陳定强，吴爱武.耐亚胺培南铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶检测[J].中国卫生检验杂志，2014，24（6）：831-833.

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[8]  刘心伟，王志盛，许晓娜，等.河南省中医院881株铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶流行情况分析[J].现代预防医学，2018 45（18）：3389-3392.

[9]  万强，李娟，陈杨.辽宁省大连市耐亚胺培南铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶基因检测及脉冲场凝胶电泳分型[J].疾病监测，2017，32（1）：38-42.

[10]  Christos I，Athanasiou，Angeliki Kopsini.A systematic review on the use of time series data in the study of antimicrobial consumption and Pseudott[J].Journal of Global cro Desist ance Volume，2018，14（23）：225-236.

[11]  史今凡.铜绿假单胞菌耐药性分析及金属β-内酰胺酶检测[J].首都食品与医药，2016，23（10）：97-98.

[12]  Samaneh Shirazi， Jalil Rashedi， Behroz Mahdavi Poor. A Comparison of Multidrug Resistance Rates of Pseudomonas Aeruginosa Strains in Burn Patients in Iran in 2006 and 2015[J].Hospital Practices and Research，2018，1（3）：654-662.

（收稿日期：2019-06-28）