严继贵 (安徽医学高等专科学校护理学部 药学系，安徽 合肥 230601)

赵正梅，盛夕曼 (安徽医学高等专科学校护理学部，安徽 合肥 230601)

杨宇清 (安徽医学高等专科学校药学系，安徽 合肥 230601)

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)具有无限增殖、分化及迁移的特性，既可直接用于干细胞移植，亦可作为基因治疗的载体。目前，NSCs移植研究多集中于脑部疾病，移植的NSCs经增殖与分化后，补充、替换和修复死亡及损伤的脑细胞[1]，以期治愈脑部疾患。随着研究的深入，研究者发现NSCs不仅具有神经再生、结构修补或替代、神经重塑、神经保护等作用[2～4]，其治疗范围亦不局限于脑损伤。有学者经蛛网膜下腔移植NSCs修复大鼠脊髓损伤及治疗坐骨神经痛[5]，也就是说NSCs移植在治疗神经病理性疼痛方面有一定作用。白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是一种抗炎因子，能有效减轻脑损伤的炎症反应，既能为NSCs移植提供较好的微环境，又能减轻炎症对神经病理性疼痛的刺激作用[6]。故本实验将IL-10与胎鼠中脑NSCs共培养，体外观察其对NSCs增殖与分化的影响，并通过免疫荧光法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)和神经元特异烯醇化酶(NSE)等相关指标，以探讨其可能的作用机制，为后续应用IL-10-NSCs移植治疗神经病理性疼痛等奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

孕14d清洁级Sprague-Dawley大鼠，由安徽医科大学实验动物中心提供。重组人IL-10购自美国Promega公司，高糖DMEM/F12、特级胎牛血清(FBS)购自美国Hyclon公司，N2添加剂购自美国Gibco公司，碱性成纤维蛋白因子(basic-fibroblast growth factor，b-FGF)购自美国Sigma公司，兔抗caspase-3多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司(PR-0284)，抗nestin多克隆抗体购自美国Abcam公司(ab6142)，兔抗NSE多克隆抗体(bs-1027R)、兔抗GFAP多克隆抗体(bs-0199R)购自北京博奥森有限公司， FITC标记的兔抗大鼠多克隆抗体(BA1108)、Cy3标记的大鼠抗兔多克隆抗体(BA1032)购自武汉博士德生物工程有限公司。

恒温二氧化碳培养箱购自德国WTCBinder公司，超净工作台购自苏州净化设备厂，GIS-2020凝胶图像处理系统购自上海天能科技有限公司，倒置显微镜及成像系统(ECLIPSE Ts2)购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

实验分4组：空白对照组；高剂量组：IL-10质量体积分数为100μg/L；中剂量组：IL-10质量体积分数为50μg /L；低剂量组：IL-10质量体积分数为10μg/L。

1.2.2 胎鼠中脑NSCs培养、传代、分化

将孕14d的SD胎鼠中脑制成单细胞悬液，置于无血清培养基(含1%N2的DMEM/F12)中悬浮培养，种植密度为1×106/mL，隔天半量换液，每日按10ng/mL添加bFGF，余同中脑神经元培养。5d后用1mL移液器轻轻吹打10～15次，将悬液按800rpm离心8min。半量去上清，再吹打10～15次，行传代培养。另在24孔培养板中铺满已包被多聚赖氨酸(poly-l-lycine，PLL)的盖玻片，将剩余NSCs悬液移入其中，半量加入DMEM/F12分化液(含10%FBS)，24h后加入全量分化液，培养1周后行免疫荧光化学实验。实验组在增殖、传代及分化培养中IL-10质量体积分数保持不变。

在倒置显微镜下观察神经球的生长状况，边缘整齐否、有无光晕；台盼蓝染色观察NSCs活力及传代次数；诱导分化后神经球贴壁时间、分化状况。

1.2.3 免疫荧光染色及图像分析

每个指标，每组对应任取6孔细胞吸去培养基，PBS洗5min，连续洗3次。加入4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次(5min/次)后，用0.4%TritonX-100透膜10min，加入封闭液封闭15min，分别滴加一抗nestin(1∶400)、Caspase-3(1∶50)、NSE(1∶75)、 GFAP(1∶200)，4℃过夜。PBS洗3次，每次5min；滴加FITC标记的兔抗大鼠多克隆抗体和Cy3标记的大鼠抗兔多克隆抗体，避光孵育1h，PBS洗3次(5min/次)，再用蒸馏水洗10min，甘油封片。每组取6张玻片，荧光显微镜下随机取4个视野进行拍照，使用Image-Pro Plus专业图像分析软件分析神经球和阳性细胞的累积光密度值(IOD)值。

1.2.4 统计学分析

2 结果

2.1 NSCs培养、传代及诱导分化

培养24h即见神经球，3d后其边缘整齐晶莹透亮，活力好(图1(a))。传代培养结果显示，高、中剂量组NSCs可传5代，高剂量组细胞活力(p5=67%)高于中剂量组(p5=51%)，另2组可传3代。加入血清24h神经球贴壁，48h有分化细胞长出(图1(b))，1周后高、中剂量组NSCs分化程度最高(图1(c))，低剂量组次之，对照组最差。

2.2 加入IL-10促进NSCs增殖及向神经胶质细胞分化

免疫荧光结果显示，神经球呈nestin阳性染色(图1(d))，即表达NSCs特异性标记物nestin蛋白；IL-10质量体积分数为100μg/L的高剂量组神经球nestin表达量最大(1943574.61±324851.45)，与中、低剂量组及对照组相比，有统计学差异(P<0.05)；IL-10质量体积分数为50μg/L的中剂量组(1122378.63±553472.08)和IL-10质量体积分数为10μg/L低剂量组(1087813.92±534776.30)神经球nestin表达量无统计学差异(P>0.05)，但2组分别与对照组(490071.02±181824.56)相比，均有统计学差异(P<0.05)(见表1)。加入IL-10后，体外培养的胎鼠大鼠中脑NSCs增殖显著。凋亡基因蛋白Caspase-3的表达以对照组(2351253.00±101321.54，与其他3组相比作用最强(图2(d))，高剂量组与中剂量组相比，无统计学差异(P>0.05)(见图2(a)、(b))，低剂量组Caspase-3的表达(1325947.90±181482.68)与其余3组相比，有统计学差异(P<0.05)(见表1、图2(c))。高、中、低剂量组NSCs增多可能与抑制凋亡基因Caspase-3表达有关，其机制可能是加入IL-10后，通过某种特定路径抑制了Caspase-3的表达。

注： (a)原代培养3d的神经球；(b)贴壁培养48h的神经球；(c)贴壁培养1周后高、中剂量组NSCs分化程度最高；(d)呈nestin染色阳性的神经球。Bars=50μm in (a～d)。图1 各组NSCS体外培养和分化

组别Nestin/1 Caspase-3 /1对照组490071.02±181824.562351253.00±101321.54高剂量组1943574.61±324851.45a848715.63±64934.77a中剂量组1122378.63±553472.08ab935672.52±403184.70a低剂量组1087813.92±534776.30ab1325947.90±181482.68abc

注：与对照组比较，aP<0.05；与高剂量组比较，bP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05。

注： (a)高剂量组Caspase-3表达很弱；(b) 中剂量组Caspase-3表达亦很弱；(c) 低剂量组Caspase-3表达较强；(d)对照组Caspase-3表达最强。Bars=50μm in (a～d)。图2 各组凋亡基因蛋白Caspase-3的表达

GFAP染色显示，高剂量组表达最强(103343478.30±11652062.31)(见图3(a))，中剂量组次之(79390065.33±12071396.27)(见图3(b))，低剂量组较弱(49261482.33±17002176.95)(见图3(c))，对照组最弱(21470592.54±10412377.04)(见图3(d))，各组比较均有统计学差异(P<0.05)(见表2)。加入IL-10后，可促进体外培养的胎鼠大鼠NSCs向神经胶质细胞分化，并呈浓度依赖性。由表2及图4可以看出，各组NSE染色并无统计学差异(P>0.05)。加入IL-10后，对体外培养的胎鼠大鼠NSCs向神经元方向分化无明显影响。

注： (a) 高剂量组GFAP表达最强；(b) 中剂量组GFAP表达较强；(c) 低剂量组GFAP表达较弱(d)对照组GFAP表达最弱。Bars=50μm in (a～d)。图3 各组GFAP表达情况

表2 各组神经球分化后GFAP、NSE阳性细胞IOD值比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与高剂量组比较，bP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05。

注： (a) 高剂量组、(b) 中剂量组、(c) 低剂量组、(d)对照组NSE阳性染色细胞无统计学差异。Bars=50μm in (a～d)。图4 各组NSE阳性染色细胞

3 讨论

神经干细胞是神经系统的始祖细胞，具有无限增殖、分化、迁移、趋化和低免疫原的生物特性[7]。干细胞的多潜能和自我更新特性赋予其在缺血、变性条件下以及创伤中再生丢失组织的能力，以帮助减轻脑损伤及改善脑损伤后的功能[8, 9]。研究表明，移植诱导分化的神经干细胞的治疗效果优于直接移植未经分化的神经干细胞，经诱导分化为不同阶段的神经细胞再用于移植时，可显著降低成瘤风险[10～13]。目前，NSCs的应用不仅仅局限于移植治疗脑损伤疾患，Sacco等[14]认为通过移植NSCs有可能治愈神经精神类疾病，并推测神经发育障碍的原因是NSCs增殖与分化的失衡所致。Ebrahim等[15]将体细胞重新编程转化，诱导出所需NSCs，利用直接转化/转分化过程，绕过多能状态，从而减少肿瘤发生和遗传不稳定的风险。尽管如此，NSCs的临床应用仍面临诸多难题，如何调控NSCs增殖，如何诱导NSCs定向分化成目标细胞，如何减轻脑损伤导致的炎症反应对移植NSCs造成的影响等。

IL-10是Ⅱ型辅助T细胞分泌的细胞因子，不仅在免疫调节中起重要作用，还是调节巨噬细胞分泌的主要因子[16]。当中枢神经损伤时，IL-10能降低过度而有害的免疫应答，并能激活浸润的巨噬细胞，削弱胶质瘢痕生长，促进受损的神经细胞修复[17]。而IL-10基因敲除的大鼠在永久性大脑中动脉梗死后死亡率明显增加[18]。因此，众多学者在研究NSCs移植时想方设法提高IL-10的分泌水平，以减轻脑损伤的炎症反应，从而创造出利于移植NSCs增殖分化的微环境。Zhang等[19]将NSCs与IL-10制成混悬液进行移植，以降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。Xu等[20]将NSCs诱导分化成神经元，并加入白细胞抑制因子(LIF)，通过激活PI3K/Akt信号途径，促进IL-10分泌，从而改善神经元的存活。可见，在NSCs移植应用研究中IL-10愈来愈受到重视。笔者将IL-10与NSCs共培养，通过检测NSCs、神经元和神经胶质细胞的特异性标记物nestin、NSE和GFAP来观察其增殖及分化情况。另外凋亡基因Caspase-3表达量的比较可以判断凋亡对NSCs存活率的影响[21]。结果表明，IL-10能显著促进NSCs增殖，一方面与其内在的分子机制相关，另一方面可能与抑制Caspase-3表达相关，减少了NSCs凋亡的发生。同时，IL-10能促进NSCs向神经胶质细胞分化，但对其向神经元方向分化作用不显。

综上所述，IL-10不仅能减轻脑损伤的炎症反应，为移植NSCs创造有利的微环境，还能促进NSCs增殖，并影响NSCs的分化。下一步将构建表达IL-10的NSCs，进行体内移植，并进一步研究IL-10 影响NSCs增殖分化的具体分子机制，为后续应用IL-10-NSCs移植治疗神经病理性疼痛提供实验依据。