刘丽华 ，张松山，张禧庆，孙宝忠，雷元华，修建胜，谢 鹏

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.烟台杰科检测服务有限公司，山东莱阳 265231）

关键字：“注水肉”；水分/蛋白质；筛查；聚类分析

自20世纪80年代肉类市场放开经营以来，“注水肉”行为一直屡禁不绝，成为严重危害消费者健康的食品安全问题[1-3]。原国家商务部2001年颁布实施的《畜禽肉水分限量》（GB 18394—2001）国家强制标准，为监管部门提供了执法依据。因当时注水手法单一，在实施初期，该标准对“注水肉”行为起到了极大的震慑作用，有效保障了人们的食品安全，取得了良好的社会效益[4-6]。然而近年来为了躲避监查，不法商贩不断升级畜禽肉注水手法，从单纯注水发展为注水与注射或灌服违法添加物相结合，以达到增大注水量，且肉中水分含量不超标的目的[7]。

与之相应的“注水肉”鉴别手段也从最初的水分含量鉴别[8-9]、感官鉴别[10]、试纸法鉴别[11]、违法添加物筛查[12]等，发展到利用低场核磁技术结合主成分分析方法，来区分生鲜肉与“注水肉”[13-14]，利用光谱技术建立“注水肉”判别模型等[15-16]。但从实效来看，这些技术手段准确性有待提高，震慑效果不佳[17]，且需要较长的检测时间或专业的检测人员，不利于现场快速筛查。从生理学和病理学角度来看，肉中注水必然会造成机体或肌肉组织中，与水分存在状态有关的某些敏感指标的特异性变化[18]。因此，本研究利用HE 染色法、核磁检测技术和统计学聚类方法，以生鲜肉和“注水肉”中水分、蛋白质、脂肪含量以及水分和蛋白质比值为关键指标，来呈现肉品的指征性变化规律，从而达到鉴别“注水肉”的目的。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选择相同饲养条件下，体质量为（95±5）kg的杜大长三元杂交猪234头；随机选择其中153头为生鲜肉组，剩余81头为“注水肉”组。“注水肉”模型建立：先对“注水肉”组活猪，肌内注射现场收缴的违法注水添加物，2 h 后灌服6 kg 清水，以后每间隔3 h 灌服1次，连续2次，2 h 后再灌服1次。对所有试验活猪，按照《生猪屠宰操作规程》（GB/T 17236—2008）屠宰；取左侧胴体背最长肌1 kg，密封后置于4 ℃保温箱中迅速运回实验室，进行相关指标测定。制备HE 组织切片样品时，取背最长肌，沿肌纤维纹理切割约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肌肉组织块，10%甲醛溶液固定。

1.2 试验仪器

BS214D 型电子天平，购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；KD-BM 生物组织包埋机，购自浙江金华科迪仪器设备有限公司；Nikon YS100显微镜，购自南京江南光电股份有限公司；Meso MR23-060H-1型台式核磁共振分析仪，购自上海纽迈电子科技有限公司；KDY-9820型凯式定氮仪，购自北京通润源机电技术有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 组织结构测定参考任秋斌[20]的HE 染色法，将HE 组织切片样品，用4%甲醛溶液浸泡48 h，再切割成0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm 大小的组织块，用水冲洗，70%酒精脱水过夜，二甲苯透明20 min 后组织包埋、修片、切片、染色，中性树胶封片后显微拍照。

1.3.2 水分分布测定将样品切割成1 cm×1 cm×1 cm 大小的块状，用核磁共振分析仪，测量核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）横向弛豫时间（T2）。测定时，仪器参数设定选择：CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence）序列，测量温度32 ℃，质子共振频率SF=23 MHz，偏移频率O1=286.195 4 kHz，累加次数NS=6，采样点数TD=384 996，PRG=1，模拟增益RG1=20，半回波时间DL1=0.12 ms，回波数NECH=14 000，P1=17 s，P2=35 us，Tw=3 500 ms。每个样品重复测量3次。

1.3.3 营养成分测定参照《食品安全国家标准食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）[21]方法，测定水分含量；参照《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.3—2016）[22]中第一法：凯式定氮法，测定蛋白质含量；参照《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》（GB 5009.3—2016）[23]中第一法：索式抽提法，测定脂肪含量。

1.4 数据统计分析

利用Excel 软件，处理试验数据；采用IBM SPSS Statistics 20、成组t 检验方法，进行组间差异显著性分析。分析时采用双侧检验，试验数据采用均值± 标准差（mean±SD）表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。采用IBM SPSS Modeler 软 件，使 用K-Means 析算法，对试验数据进行聚类分析；使用反演拟合软件V4.09（上海纽迈电子有限公司），分析水分分布的弛豫时间。

2 结果与分析

2.1 肌纤维组织

生鲜肉肌纤维的纵切面组织形态（图1-A）显示，纵切面完整，肌细胞被白色的结缔组织隔开，形态较好；肌纤维排列紧密，肌浆丰富，染色深，横纹清晰。生鲜肉肌纤维的横切面组织形态（图1-B）显示，横断面肌纤维排列紧密，肌浆丰富，染色均匀。

“注水肉”肌纤维的纵切面组织形态（图1-C）显示，纵切面完整，肌细胞边界模糊，形态较差；肌纤维肿胀，呈卷曲波浪状，结缔组织断裂，着色呈现不规则的红白相间条纹状（肌浆流失造成发白），有的整个肌纤维呈灰白色，也有肌纤维断裂现象。“注水肉”肌纤维的横切面组织形态（图1-D）显示，肌浆稀疏，着色浅淡，纤维整体排列无序。

2.2 水分分布

横向弛豫时间测量结果（图2）显示：不同弛豫时间处的特征峰与肉中存在的不同状态水是对应的，即T21、T22和T23（由左至右依次对应的峰）分别表征样品中的结合水、不易流动水和自由水的核磁响应信号[24]。

生鲜肉和“注水肉”的弛豫时间和峰面积比的成组t 检验分析结果（表1）显示：生鲜肉的T21起峰时间和峰顶时间显著晚于“注水肉”（P＜0.05），T22结束时间显著早于“注水肉”（P＜0.05），峰面积比P21显著小于“注水肉”（P＜0.05），峰面积比P22显著大于“注水肉”（P＜0.05）。

2.3 营养成分测定

图1 生鲜肉和“注水肉”的肌纤维结构

图2 生鲜肉与“注水肉”的典型横向弛豫时间（T2）

生鲜肉和“注水肉”营养成分的成组t 检验差异分析结果（表2）显示：生鲜肉的蛋白质含量显著高于“注水肉”（P＜0.05），脂肪含量略低于“注水肉”；生鲜肉和“注水肉”的水分含量存在显著差异，但二者数值均未超过《畜禽肉水分限量》（GB 18394—2001）所规定的限量值（77%）；生鲜肉的水分/蛋白质比值显著低于“注水肉”（P＜0.05）。

2.4 营养成分分布规律

生鲜肉和“注水肉”的水分含量分布（图3-A）显示，生鲜肉的水分含量为73.3%～76.6%，“注水肉”为74.2%～76.6%。二者分布区域基本重合，无法有效加以区分。生鲜肉和“注水肉”的脂肪含量分布（图3-B）与水分含量分布呈现相同趋势。

表1 T2的峰时间（ms）和面积比（%）分布

生鲜肉和“注水肉”的蛋白质含量分布（图3-C）显示，生鲜肉的蛋白质含量为20.9%～23.6%，主要集中在22%左右；“注水肉”为18.0%～22.0%，主要集中在19%左右；二者虽具有统计学差异（P＜0.05），大部分可以有效区分。

水分/蛋白质比值的分布结果（图3-D）显示，生鲜肉的水分/蛋白质比值为2.80～3.95，主要集中在3.50左右；“注水肉”的水分/蛋白质比值为3.38～4.82，主要集中在4.00左右。二者存在明显差异（P＜0.05），大部分可以有效区分。

表2 营养成分含量和水分/蛋白质比值测定结果

图3 水分、蛋白质、脂肪以及水分/蛋白质比值分布

2.5 营养指标聚类分析

以水分、蛋白质、脂肪、水分/蛋白质比值作为数据源，使用K-Means算法聚类划分生鲜肉和“注水肉”。设置聚类数为2，得出在类别1和类别2中生鲜肉和“注水肉”的个数（表4）。以水分和脂肪分别作为聚类分析项，结果显示生鲜肉和“注水肉”的分布差异不显著（P＜0.05）。以蛋白质和水分/蛋白质比值分别作为聚类分析项，结果显示生鲜肉和“注水肉”在两个类别中分布差异都较大（P＜0.05）。利用类别1中“注水肉”识别个数除以“注水肉”样品总数计算“注水肉”识别率，各分类项的“注水肉”识别率为80.2%、79.0%、80.2%和88.9%；利用类别2中生鲜肉的识别个数除以生鲜肉总数，计算各分类项的生鲜肉识别率分别为49.7%、94.8%、49.7%和96.7%。结果可见，水分/蛋白质的识别率高于其他分类项。

表4 聚类分析聚类中样品个数结果

3 讨论

HE 染色是肌肉组织学观察的主要方法[25]。李志强[26]研究发现，生鲜猪肉组织的肌纤维排列整齐且纹理清晰可辨别。王彦丽等[27]研究发现，注水行为可使肌细胞渗透压发生显著变化，造成肌细胞破裂，组织形态破坏，因而“注水肉”组织结构呈现肌肉色泽变淡和结缔组织红白花纹不明显的特点。本研究的生鲜猪肉和“注水肉”组织观察结果与以上研究一致。

通常认为LF-NMR 多组分横向弛豫图中，T21反映了与大分子紧密结合的水分，T22反映了蛋白质结构中的水分，而T23则反映了肌纤维外蛋白质晶体结构中存在的水分[28-29]。弛豫时间越短，表明对应水分与底物结合越紧密，水分流动性越低；弛豫时间越长，表明对应水分与底物结合越松散，水分流动性越强[30-31]。本研究发现：“注水肉”的T21起峰和峰顶时间显著早于生鲜肉（P＜0.05），P21显著大于生鲜肉（P＜0.05），T22峰面积显著小于生鲜肉（P＞0.05），P22显著小于生鲜肉（P＜0.05）。这与前人研究[32-34]结论一致。而生鲜肉和“注水肉”的T23弛豫时间和峰面积比无显著差异，与王胜威等[35]研究的“注水肉”的T23峰面积显著增大（P＜0.05）不一致，其原因可能是其研究利用的是向生鲜肉中直接注水后静置而建立的“注水肉”模型，水分在肉块中可能多以自由水的形式存在。通常情况下，水的流动性越强，弛豫时间越长，自由水的峰面积增大[30]。本研究则是按照现行违法注水操作，活体灌注后采集的样品，因而更具有真实性和代表性。相较于单纯肌肉注水模型，生猪活体注水后必然会引起机体复杂的代谢、代偿反应，同时违法添加物也会影响肌肉组织中水分的流动性，因此导致了本研究中“注水肉”自由水的峰面积比与此前的其他研究不一致。肉的保水性主要取决于肌肉对不易流动水的保持能力。不易流动水主要存在于纤丝、肌原纤维及膜之间。研究显示，不论是肌肉注射水模型，还是本研究使用的活体注射违法添加剂结合水分灌注模型，T22弛豫时间均延长，表明注水行为都对肌肉组织结构产生了损伤，这一点从HE 染色组织学研究也得到了证实。

对比生鲜肉和“注水肉”的水分含量分布可以发现，二者水分含量分布区域基本重叠，不能有效区分“注水肉”，且“注水肉”的水分含量值基本不超过77%的限量值。对生鲜肉和“注水肉”的水分、蛋白质和脂肪的测定结果表明，生鲜肉和“注水肉”单位质量内的脂肪和蛋白质含量发生了显著变化，大大降低了单位肉品中有效营养成分比例[27]。通过含量分布图发现：水分和脂肪含量指标分布区域极度重叠，无法有效区分生鲜肉和“注水肉”；而蛋白质含量和水分/蛋白质比值分布差异显著，可大体区分两者。

有资料[36]显示，在巴西农业畜牧和食品供应部发布的2010年第32号技术规范中，不仅对分割鸡肉的水分含量和蛋白质含量范围提出了要求，并且对水分/蛋白质比值的范围也提出了明确要求。由此可以看出，水分/蛋白质比值已经被一些国家和地区作为评价肉品质量的关键指标。

本研究以营养成分作为聚类分析项，来鉴别生鲜肉和“注水肉”，发现以水分/蛋白质比值的聚类分析结果为最优，其中“注水肉”的识别率为88.9%，生鲜肉的识别率为96.7%，说明利用水分/蛋白质比值能够较准确鉴别生鲜肉和“注水肉”。但受样本量的限制，其具体阈值还有待通过大样本量的测定后加以确定。同时，未来指标阈值的确定可能还要根据物种、品种、年龄等不同而分别研究确定。本研究利用低场核磁技术，重点分析了二者的水分分布差异以及“注水肉”模型特性，因此仅随机各选取6个生鲜肉和“注水肉”样品进行对照分析，而对于所有样品的检测分析，待后续进一步细化研究。

4 结论

本研究模拟当前违法注水案件所采用的方法建立注水肉模型，从水分、蛋白质、脂肪含量以及水分/蛋白质比值等判别“注水肉”指标中，筛选出水分/蛋白质比值为“注水肉”判别的指征性筛查指标，但需进一步研究确定指标阈值。