黄晓，张恬，马朝芝，刘焱文，余坤*，黄必胜*

1.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉 430065；2.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700

鞘蕊苏药材的基原植物为毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii(Wild.)Briq.，主产于印度，在中国云南、福建亦有分布，被植物学家界定为珍稀植物[1]。鞘蕊苏以全草入药，民间主要用于治疗哮喘[2]、咳嗽等疾患，疗效很好[3]。鉴于鞘蕊苏良好药效作用，本实验室与企业实施产学研结合，以鞘蕊苏为君药，开发了鞘蕊苏胶囊。现代科学研究表明，鞘蕊苏有效成分为二萜类化合物异佛司可林(isoforskolin)[4]。

萜类化合物以5碳异戊二烯(IPP)及其异构体二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)为原料[5]，通过异戊二烯转移酶催化连接而成。IPP和DMAPP以“头-尾”方式相连形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)[6]，通过法尼基焦磷酸合成酶(FPS)的作用，GPP与1分子IPP结合形成法尼基焦磷酸(FPP)[7]，再通过牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)作用，FPP与1分子IPP形成牻牛儿基焦磷酸(GGPP)[8]，GGPP是二萜化合物的前体物质。本研究通过反转录PCR技术克隆得到赤霉素氧化酶基因，并成功地构建了基因的表达载体。通过对GA氧化酶基因的克隆及表达载体构建，研究二萜类化合物的合成途径中相关酶的功能，为提高湖北通城种植鞘蕊苏药材中异佛司可林含量奠定基础。

1 材料

鞘蕊苏植物移植自湖北省通城县鞘蕊苏药材集中种植基地，经湖北中医药大学药学院生药教研室吴和珍教授鉴定为唇形科植物毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii(Willd.)Briq.，将其植株种植于实验室，保证植株健康的生理状态，以备后续实验需要。

pMD18-T Vector(大连宝生物科技有限公司)，DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)，PGEX-4T-1表达载体(中国医学科学院药用植物研究所陈士林课题组赠予)，QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN技术有限公司)，质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)，3′-FμLl RACE试剂盒、LaTaq酶、DNA Marker(TaKaRa公司)，2×EasqTaqMix(北京全式金生物技术公司)，Hind Ⅲ和XbaⅠ限制性内切酶、PrimeScripTM 1stStrand cDNA synthesis Kit.SYBR PrimeScripTM RT-PCR Kit、Primer start Gxl高保真酶、DNA Marker(TaKaRa 公司)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 鞘蕊苏赤霉素CfGA01全长的克隆

步骤1：选取高通量转录组测序分析结果中的赤霉素氧化酶基因片段，设计5′引物(CfGAS-outer TCTGGCGGCACTGAAATCCA，CfGAS-inner CCAGA-ATCTCGCACGCCATCTT)、3′引物(CfGAS-outer CTTGTGGTAGTTAGAATGGGC，CfGAS-inner TTGAAGA-AGCCCACCTCCT)进行巢氏RACE实验，得到基因全长序列。

步骤2：利用DNAMAN软件根据全长基因序列设计引物，并引入酶切位点(CfGAS-F-EcoR I gaattcACAACCACCACCAACACTCATCTCTCT，CfGAS-R-SalⅠgtcgacACCGGATGGAAGGGAGGGAACATTA)，用高保真DNA聚合酶扩增全长，反应体系(Prime star Gxl Polymerase 1 μL、5×Prime star Gxl Buffer 10 μL、F 1 μL、R 1 μL、cDNA 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、RNase free dH2O 28 μL)，PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃冷却，待反应结束后将产物取出置于4 ℃保存。分别用EcoR I、SalⅠ对提取的重组质粒与表载体PFEX-4T-1进行双酶切反应，反应体系(质粒/PFEX-4T-1 10 μL、10×K Buffer 5 μL、酶1 1 μL、酶2 1 μL、RNase free dH2O 33 μL)，反应条件：37 ℃反应3～8 h，65 ℃水浴15 min灭活限制性内切酶。

步骤3：用T4连接酶将载体和质粒双酶切后的产物进行连接，得到带有目的基因的重组质粒，具体反应体系及条件如下：连接酶T4 1 μL、10×T4Buffer 1 μL、载体胶回收产物4 μL、质粒胶回收产物4 μL，反应条件：16 ℃空气浴连接3 h以上，取10 μL连接后的产物转化到100 mL DH5α大肠杆菌感受态细胞中，pcr筛选阳性克隆，并将阳性克隆送于生工测序，将测序结果作比对后选取准确无误的阳性单克隆2～4个，于37 ℃恒温摇菌培养过夜，用以提取质粒，将提取的质粒取少量做双酶切验证，剩余的-20 ℃保存，表达载体构建结束，挑取阳性单克隆至2 mL的无菌EP管中，LB液体培养基培养2 h作为母菌，并加入40%甘油混匀，于-80 ℃保存[9]。

2.2 实时荧光相对定量PCR

利用百泰克多糖多酚植物总RNA抽提试剂盒提取鞘蕊苏根、茎、叶和花各个组织的总RNA，然后分别用1%的琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop 2000)通过波长(A)检测总RNA的质量和浓度。利用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit试剂盒将上述RNA反转录得到cDNA，利用TaKaRa公司的SYBR premix ExTaqkit试剂盒在Roche公司Light Cycler 480实时荧光定量仪上进行qPCR。

2.3 CfGA01基因功能验证

将重组表达载体与空载体PGEX-4T-1转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，含空载体的大肠杆菌将被用作对照菌，利用IPTG诱导启动子在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达萜类合成酶基因，并确定蛋白表达的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度。

3 结果与分析

3.1 RNA提取

通过琼脂糖凝胶电泳(1.0%)检测鞘蕊苏根部和叶中提取的总RNA，观察是否能清楚地看到28 s和18 s的条带，由图1观察条带清晰可见。将跑胶后的总RNA溶液用Nanodrop2000检测浓度和纯度，其A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值分别为2.01和2.13，表明有轻微降解，但它不影响后续实验的正常过程。

图1 鞘蕊苏根和叶中提取的RNA的电泳图

3.2 3′、5′-RACE扩增

根据高通量测序片段设计GSP1和GSP2引物。通用3′引物和5′引物进行巢式扩增，通过研究不同的退火温度，扩增3′端和5′端得到与目标片段大小一致的条带。通过凝胶回收目的片段，并将目的片段的胶回收产物与PMD18-T载体连接，连接产物转DH5α感受态细胞中，菌落过夜生长，通过PCR挑选阳性克隆，选择2～4个阳性克隆进行序列测序。通过凝胶电泳发现CfGA013′端最佳退火温度为62 ℃，5′端最佳退火温度为50 ℃(见图2)。

图2 3′RACE、5′RACE凝胶电泳图(由上到下)

3.3 鞘蕊苏CfGA01基因全长的拼接

测序结果用MEGA 6.0进行拼接，DNAMAN 6.0软件进行分析，比对结果显示CfGA01基因的总长度为1234 bp，包括5′非编码区72 bp，993 bp开放阅读框区，169 bp 3′非编码，终止密码子为TAA。氨基酸数量为408，分子量为45 874，其中开放阅读框中的氨基酸数为355，分子量为39 606。见图3。

3.4 CfGA01系统进化树

山茶花Camellialipoensis、丹参SalviamiltiorrhizaBunge、牵牛花Ipomoeanil、大麻Marahmacrocarpa、毛状烟草Nicotianatomentosiformis、野生烟草N.attenuata、美花烟草N.sylvestris、烟草N.tabacum、矮牵牛Petuniaxhybrida、节节麦Aegilopstauschiisubsp.tauschii、小麦Triticumaestivum植物的GAS蛋白进行多重比对，发现它们具有较高的同源性(见图4)。通过构建系统进化树，发现CfGA01蛋白与丹参GA蛋白的亲缘关系比较近。

3.5 qPCR分析

CFGA01参与赤霉素合成，赤霉素是植物中的二萜类植物激素，能够促进植物生长，对整个发育过程起着重要作用。图5 qPCR结果表明CfGA01在根、茎、花和叶各个组织中都有分布，而分布于叶和花中相对较高。

3.6 原核蛋白表达分析

通过图6 SDS-PAGE检测结果显示，IPTG浓度为1 mol·L-1后，温度为20 ℃时，在上清液中有表达，但表达较少，大量蛋白成为包涵体。

4 讨论

赤霉素在植物生长和发育中起着重要作用，如种子萌发、叶芽生长、叶柄伸长、叶片扩大、花形成和发育、果实成熟等都与赤霉素有着重要联系。一般来说赤霉素的合成主要发生在植物的顶端部位，即分生能力较强的部位，如顶芽、发育叶和根尖。近年来随着植物功能基因组学和蛋白质组学的发展，赤霉素研究取得重大进展，特别是赤霉素生物合成途径，起关键作用的酶基因已在许多植物中克隆出来，如在拟南芥、水稻、豌豆、玉米、西红柿、草莓、莴苣、烟草、大麦和南瓜等植物中都发现了参与赤霉素合成与代谢的基因[10]，然而在鞘蕊苏中相关基因报道较少。

本研究基于前期外源性GA处理植株有效成分含量减少的现象，首次克隆并表达了鞘蕊苏中赤霉素氧化酶CfGA01，基因表达蛋白与烟草、小麦、丹参等的相似性都在80%以上，进化关系与丹参最相近，表明该基因序列比较保守。在qPCR的实验中，研究发现鞘蕊苏中赤霉素氧化酶在叶中表达量最多，而在根中表达量较少，这种表达趋势不同于模式植物拟南芥和水稻的研究[11]，表明鞘蕊苏中赤霉素氧化酶的合成及富集有其独特性。在鞘蕊苏不同组织中有效成分异佛司可林含量的研究中，发现叶中异佛司可林含量最低，而根中含量最高，这同赤霉素氧化酶的表达量正好相反。赤霉素与异佛司可林由共同的前提化合物经过生物反应得到，研究赤霉素氧化酶的功能，为研究异佛司可林的生物合成提供科学依据，为后续提高栽培鞘蕊苏有效成分含量奠定基础。

图3 鞘蕊苏CfGA01基因全长序列图

图4 鞘蕊苏CfGA01同源系统进化树

图5 CfGA01在鞘蕊苏不同器官的相对表达量

图6 PGEX-4T-1-CfGA01蛋白表达图