李 娇，王文秀，李 峰，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS），又称猪地方流行性肺炎（porcine enzootic pneumonia, PEP），俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasmal hyopneumonia, Mhp）引起的以咳嗽、气喘、生长发育不良、高发病率和低死亡率为主要特征的一种慢性、接触性呼吸道传染病，该病长期存在并严重威胁着我国养猪业健康发展[1-2]。猪肺炎支原体常常与多杀性巴氏杆菌、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）等致病原继发感染或混合感染[3]。当其单独感染时，仅出现亚临床症状，表现温和，可引起平均日增重和饲料转化率降低。当其与其他致病原继发感染时，出现呼吸困难、发热等典型临床症状，增加了呼吸道疾病的严重性和持久性，导致死亡率上升，防控难度增加。该病具有感染率高、传染性强的特点，一旦传入猪群，很难彻底清除，是目前影响我国养猪经济效益的顽固性疫病之一，给我国养猪业带来巨大的经济损失。加强流行病学监测和诊断技术研究对该病综合防控措施的制定具有十分重要的现实意义。为全面掌握目前我国猪群中猪肺炎支原体的流行现状，笔者通过查阅2000 年以来我国研究学者在病原分离鉴定、流行病学监测、遗产变异分析等方面的研究资料，整理与分析出了目前我国猪支原体肺炎的感染现状与流行特点，并综述了猪肺炎支原体实验室检测技术研究进展，对我国猪支原体肺炎的综合防控具有重要的参考价值。

1 病原分离鉴定情况

对近十余年国内猪肺炎支原体的分离鉴定情况进行汇总分析，结果如表1 所示，可见我国猪肺炎支原体的分离鉴定成功率较低，2006—2016 年国内研究学者共从164 份临床病料样品中成功分离鉴定出猪肺炎支原体9 株，病原分离鉴定成功率仅为5.49%（9/164），分析其原因可能为猪肺炎支原体对营养和培养条件要求极其苛刻，导致其成功分离鉴定率极低，成为当前最难分离的支原体种类之一。同时，由表1 可见猪肺炎支原体在我国的感染范围较广，9 株猪肺炎支原体分离株覆盖了由南到北的云南省、广东省、湖南省、四川省、江苏省、河南省、山西省、山东省、吉林省等9 个省份，呈全国性流行。

表1 猪肺炎支原体分离鉴定情况汇总

2 流行病学监测情况

随着我国对猪肺炎支原体感染的逐步重视，研究学者先后对不同地区的猪肺炎支原体感染情况进行了流行病学监测，结果如表2 所示，我国不同地区均存在不同程度的猪肺炎支原体感染，感染情况比较普遍，且在部分地区感染率较高，感染情况比较严峻，如2014 年广东东莞地区的感染率高达86.92%，2016 年西藏林芝地区的感染率达72.69%。猪肺炎支原体已在我国猪群中广泛流行，需采取积极的综合防控措施进行有效防制。

表2 猪肺炎支原体流行病学监测情况汇总

3 遗传变异分析情况

对猪肺炎支原体进行遗传变异分析可以从分子水平发现不同时间、不同地区流行株之间的差异以及遗传和衍化规律，能够为不同地区因地制宜的制定防控措施提供参考。廖永洪等[5]对河南省HN0613分离菌株进行了P36 基因的PCR 扩增、克隆及测序，并对其序列变异、遗传进化进行分析，结果表明HN0613 分离菌株P36 基因序列与GenBank 中登录的猪肺炎支原体P36 基因序列同源性均在98%以上，HN0613 分离菌株P36 基因未发生较大变异。孔令增等[9]对猪肺炎支原体广东分离株的P46 基因、P65 蛋白C 末端的基因编码序列和P97 蛋白R1R2区域的基因编码序列进行遗传变异分析，结果表明P46 基因、P65 基因、P97 基因与标准株J 株、232 株和7448 株的核苷酸序列同源性分别为98.9%～99.1%、99.2%～99.7%、86.6%～96.0%，猪肺炎支原体广东分离株P46 基因、P65 基因片段高度保守，而P97 基因片段的变异较大。李石等[16]对新疆北疆部分地区122 份猪支原体肺炎阳性样品进行P36 基因序列分析，与参考菌株同源性为97.3%～100%，仅有个别碱基发生突变，未发生较大变异。以上分子流行病学调查资料表明，我国猪肺炎支原体的流行菌株未发生较大变异，常规疫苗能够提供良好的免疫保护。

4 实验室检测方法

猪肺炎支原体常常与多杀性巴氏杆菌、PRRSV、PCV2、PRV、CSFV 等致病原混合感染。混合感染加重了疾病的严重程度，同时也增加了猪肺炎支原体的临床诊断难度，故目前对猪肺炎支原体感染的确诊主要依靠实验室分子生物学和血清学检测技术。

4.1 PCR 方法

PCR 方法以样品基因组DNA 为模板，借助DNA 聚合酶体外大量扩增目的片段，具有简便、迅速、特异、灵敏等优点，但该方法的敏感性有限，容易漏检。李莹莹等[20]根据GenBank 中猪肺炎支原体P46基因序列设计合成1 对特异性检测引物，经PCR 反应条件的优化，建立了检测猪肺炎支原体的PCR 方法，该方法检测猪鼻支原体、猪絮状支原体、鸡毒支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌均为阴性，最低可检出0.675 ng 的基因组DNA，可满足临床上对猪肺炎支原体的快速检测要求。

4.2 荧光定量PCR 方法

荧光定量PCR 技术结合了常规PCR 方法灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，但该方法对仪器设备和技术人员操作水平要求均较高。宋建领等[21]根据GenBank登录的猪肺炎支原体黏附素P97 基因序列设计1对特异性引物和1 条探针，建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR 检测方法，该方法能特异地检测出猪肺炎支原体，检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、乙型脑炎病毒（JEV）、猪细小病毒（PPV）等病原均为阴性，检测猪肺炎支原体阳性质粒标准品的灵敏度可以达到10 拷贝，重复性检测Ct 值变异系数在0.78%～1.16%之间。实时定量PCR 方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，可用于猪肺炎支原体感染的早期诊断和流行病学调查，是一种值得推广的快速诊断技术。

4.3 巢式PCR 方法

巢式PCR 是在常规PCR 结束后，以第一轮PCR 扩增产物为模板进行第二轮PCR 扩增，故其敏感性更高，适合对病毒含量很低时的样品进行鉴定。吉玛等[22]根据GenBank 上登录的猪肺炎支原体基因组序列，在保守区基因内部设计合成2 对引物，经过PCR 反应条件的优化，建立了检测猪肺炎支原体的巢式PCR 方法，该方法检测鸡毒支原体、猪鼻支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、PCV2、PRV 均为阴性，第1 次扩增的敏感性是10 pg，第2 次扩增的敏感性是0.1 pg，第2 次比第1 次扩增的敏感性高100 倍。应用该方法检测26 份临床疑似猪肺炎支原体感染的病料，检出阳性样品15 份，随机选取10 份阳性样品PCR 产物进行克隆与序列测定，结果显示10 份阳性产物均为猪肺炎支原体。巢式PCR 方法的敏感性可与荧光定量PCR 方法相当，但所用仪器与试剂只是普通的PCR 仪器与试剂，不需要荧光定量PCR方法要求的特殊仪器设备与试剂，具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点，可以在短时间内准确快速地检测出极低含量的猪肺炎支原体，具有良好的临床实用价值。

4.4 LAMP 方法

环介导等温扩增方法（LAMP）是一种新型核酸扩增技术，其特异性和敏感性可以与荧光PCR 媲美，同时其检测周期短、操作简便、对检测硬件设备的要求较低，适合于野外现场使用。熊炜等[23]根据猪肺炎支原体基因序列设计6 对检测引物，经反应条件的优化，建立了检测猪肺炎支原体的LAMP 方法，该方法在恒温63 ℃水浴锅中作用60 min 即可完成整个反应过程，检测PRRSV、PPV、PRV、PCV2、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均为阴性。可视化LAMP 检测方法除普通离心机和水浴锅外，几乎不需要其他设备，其检测的敏感性和可靠性不低于传统PCR 方法，非常适合应用于猪场等条件简陋的基层实验室使用。

4.5 显色原位杂交法

显色原位杂交法（CISH）是近年来建立的一种新的显色反应与原位杂交相结合定位检测技术，可以在光学显微镜下原位检测目的基因扩增结果，目前应用比较广泛的非放射性标记物主要有生物素、地高辛和荧光染料。其中，用地高辛作标记物的探针，其敏感性与放射性核素标记的探针相似，是一种理想的非放射性探针标记物。王占伟等[24]利用地高辛标记猪肺炎支原体P36 基因核酸探针和DAB/H2O2显色系统，建立了检测猪肺炎支原体的显色原位杂交研究方法，该方法检测猪胸膜肺炎放线杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌和猪链球菌2 型均为阴性，应用该方法检测临床样品的检测结果低于常规PCR 检测结果。显色原位杂交法敏感性和特异性较高，并且直观，为猪肺炎支原体的致病机理和检测定位研究提供了一种技术手段和参考方法，但其敏感性有限。

4.6 间接ELISA 方法

间接ELISA 方法主要用于检测抗体，首先用特异性抗原包被固相载体，依次加入含待测抗体的样品和酶标记的第二抗体，通过底物进行显色反应，颜色深浅与待测抗体量成正比。沈青春等[25]选择猪肺炎支原体P46 膜蛋白基因亲水区序列进行克隆，并将其内3 个编码Trp 的TGA 突变成TGG，然后再克隆到pET28a 载体中，在大肠杆菌BL21 细胞内实现了高效表达，将大肠杆菌表达的猪肺炎支原体P46重组蛋白经过洗涤、过柱纯化后，作为间接ELISA包被抗原，通过对各参数和试剂的优化，建立了检测猪肺炎支原体的间接ELISA 方法，该方法与IDEXX ELISA 试剂盒的阳性符合率为84.2%，阴性符合率为91.4%，为猪肺炎支原体感染的抗体检测提供了一种高通量、检测快速、操作简单的血清学快速检测技术。

4.7 双抗夹心ELISA 方法

双抗夹心ELISA 是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。田瑞雨等[26]以抗猪肺炎支原体P46 蛋白单克隆抗体为包被抗体，抗P46 蛋白多克隆抗体为检测抗体，建立了猪肺炎支原体的双抗体夹心ELISA 方法，该方法的重复性变异系数小于10%，最低检出量为9.754 ng/mL，检测猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等均为阴性。双抗夹心ELISA 具有良好的重复性、敏感性和特异性，为猪肺炎支原体感染的诊断和流行病学调查等提供一种高通量、检测快速、操作简单的血清学方法。

4.8 胶体金免疫层析方法

胶体金免疫层析法（GICA）是结合胶体金标记技术、免疫技术、层析技术发展起来的一种新型免疫学检测技术，具有简便、快速、不需仪器设备、结果判断直观、无污染等优点，在动物疫病诊断尤其是基层兽医实验室现地诊断中得到了广泛应用。赵肖[27]通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，将其标记猪肺炎支原体特异性抗原P46 蛋白作为金标液并包被在玻璃纤维膜上，利用P46 蛋白包被检测线，利用抗P46 蛋白单抗包被质控线，建立了可用于猪肺炎支原体血清抗体检测的胶体金免疫层析检测方法。该方法检测PRRSV、PCV2、PRV、猪鼻支原体和猪滑液支原体等病原阳性血清均为阴性，检测猪肺炎支原体阳性血清的最大稀释倍数为1∶32，与商品化猪肺炎支原体ELISA 抗体检测试剂盒符合率为96.1%。胶体金免疫层析法无需特殊仪器设备、肉眼判读，具有快速、灵敏、特异、操作简便等特点，为现场检测和快速诊断提供了新的模式，在基层兽医单位具有广阔的开发应用前景。

5 结语

现阶段的感染现状分析表明，猪肺炎支原体在我国猪群中呈全国性、散发性流行，其整体感染率一直居高不下，应加强重视。对于猪支原体肺炎的各种实验室诊断技术，显色原位杂交法对试验条件要求高、费用成本高，且敏感性有限，适合致病机理和组织定位研究，不适合基层实验室快速诊断。LAMP 和胶体金方法检测快速、对仪器设备要求较低，非常适合基层实验室使用，但敏感性太高，易导致假阳性结果。PCR、巢式PCR、ELISA 方法操作简单、检测快速、高通量，是目前猪肺炎支原体临床诊断和流行病学监测的主要方法，且巢式PCR 方法的敏感性比PCR 方法还要高，但PCR、巢式PCR 方法需使用溴化乙锭（EB）对扩增产物进行检测，对环境和人体健康产生一定的威胁。荧光PCR 方法解决了PCR 方法的EB 污染问题，且能够定量检测，但对仪器和操作人员技术水平要求较高，适合有条件的实验室使用。相信随着猪肺炎支原体实验室检测技术的不断发展与成熟，我国对猪肺炎支原体的不断重视以及防控措施的不断完善，猪支原体肺炎的感染也将会逐步得到控制，进而实现猪肺炎支原体的区域性净化，并最终达到全国性净化。