刘绍雄，刘春丽，尚陆娥，李建英，王明月，吴广彪，罗孝坤

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省供销合作社科学研究所，云南昆明650221；3.云南省农村科技服务中心，云南 昆明 650021；4.施甸康宏农业科技发展有限公司，云南 保山 678000）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]，又名木耳、光木耳、黑菜[2-3]，是我国重要的食用菌栽培品种。黑木耳肉质脆嫩、味道鲜美、营养丰富，含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素及钙、磷、铁等人体所需的矿质元素[4]，被称为“素中之荤”[2]。同时黑木耳还富含木耳多糖、黑色素、腺苷类物质和甾醇等药用成分，具有润肺清肠、降血糖、降血脂、抗血栓、抗辐射、抗氧化、抗肿瘤等多种功效[4-5]，享有“黑色瑰宝”的美誉，深受广大消费者的青睐，市场前景广阔。

黑木耳在全国范围内广泛栽培，尤其以东北地区为主产区。据统计，2017年我国黑木耳产量达751.85万吨，是全国栽培产量第二大的食用菌品种，东北黑龙江和吉林两省黑木耳产量约占全国黑木耳总产量的60%以上[6]。云南地处低纬高原，独特的气候条件促使云南黑木耳栽培优势明显。云南黑木耳栽培出耳时间多集中于10月至次年4月，在冬季相对较低的温度和全日光条件下出耳，黑木耳品质突出，云南生产的高品质黑木耳，即云耳，享誉国内外。但云南黑木耳栽培规范化程度不高，栽培技术参差不齐，在排场出耳管理阶段病害尤为严重，严重影响栽培产量和产品质量。本文中，通过对云南黑木耳排场出耳管理阶段病害严重的保山地区基地，开展常见病害调查及病原菌分离鉴定研究，分析病害发生原因及病原鉴定，以期能为云南黑木耳栽培管理及病害防治提供理论依据，为筛选抗病性强的优良菌株提供供试菌株材料。

1 材料与方法

1.1 采样点概况及样品采集

1.1.1 采样点概况

以云南黑木耳排场出耳管理阶段病害严重的保山地区基地西邑 （E：99°29′41″，N：24°9′17 ″，海拔 1 656 m）、芒宽 （E：98°8′8″，N：25°53′9 ″，海拔738 m），作为病害调查和病原菌采集样点。

1.1.2 样品采集

采样时间为2018年1月～3月，采集黑木耳染病的菌棒基质和耳片。共采集病害样品9份，对采集的样品进行编号，放入冰盒中保存带回实验室进行病原菌分离。同时详细记录采集地点、采集时间、发病时间、病害症状特点等。

1.2 病原菌分离、纯化与鉴定

1.2.1 培养基

PDA培养基：马铃薯（去皮） 200 g、葡萄糖20 g、琼脂 15 g～20 g，蒸馏水 1 000 mL。

孟加拉红培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾 1.0 g、硫酸镁 0.5 g、氯霉素 0.1 g、琼脂15 g～20 g，1/3 000孟加拉红溶液100 mL，蒸馏水1 000 mL。

LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、琼脂15 g～20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2.2 菌种分离与纯化

1）细菌性病原菌的分离、纯化

培养基：LB培养基。在超净无菌工作台内，用接种针在烂耳耳片上轻轻蘸一下，在培养基平板上划线，置于37℃恒温培养箱中培养，培养12 h～24 h后蘸取单菌落于平板上进行纯化后，于4℃冰箱中保存备用。

2）真菌性病原菌的分离、纯化

培养基：PDA培养基、孟加拉红培养基。在超净无菌工作台内，从染病的菌棒基质上直接挑取一小块置于培养基平板上，置于25℃培养箱中培养。培养3 d～5 d挑取病原菌边缘菌落至平板上进行纯化后，于4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 菌株鉴定

细菌采用16S rDNA序列分析[7]，真菌采用rDNA ITS序列分析[8-9]，样品送昆明硕擎生物科技有限公司测序，用DNAMAN进行序列拼接，从GenBank中获取与该菌株序列同源性较高的部分菌株序列，并用BioEdit进行序列对齐，最后用MEGA 4软件进行系统发育树构建，以确定菌株的系统发育地位。

2 结果与分析

2.1 黑木耳常见病害调查结果

病害侵染情况见图1。黑木耳常见病害调查结果见表1。

图1 黑木耳病害症状Fig.1 Symptoms of Auricularia heimuer disease

表1 病害调查结果Tab.1 Investigation results of Auricularia heimuerdiseases

由表1可知，共采集黑木耳病害样本9份，其中芒宽6份、西邑3份。芒宽发生病害更为严重。从发病发生阶段来看，主要集中在刺孔催芽和排场出耳阶段。

由图1可以看出，病害症状主要是耳片烂耳和菌棒感染。烂耳耳片变软，有胶质流出，逐渐腐烂，有臭味。菌棒感染表面产生霉层，侵染部分呈现绿色、红色或白色菌皮，菌棒腐烂变软或形成厚厚菌皮层，导致菌棒出耳较少或不出耳。从发病规律来看，主要发生在刺孔后、下地排场后或采收第一潮耳后，气温升高、湿度增大，起初菌棒无明显现象，菌棒逐渐变软，表面开始被感染，然后迅速蔓延至整个菌棒。

根据病害症状及发生规律分析病害发生原因：黑木耳出耳后，温度过高，喷水过多或下雨湿度过大，耳片变软，易被细菌性病原菌侵染，耳片逐渐腐烂，变臭；菌丝刺孔后菌丝新陈代谢加快，菌丝呼吸作用加强，菌棒内料温升高，当环境温度较高时，菌丝催芽期间会出现高温烧菌，造成菌丝抗病能力下降；环境中的致病性强的病原菌会从接种孔，催芽孔进入侵染菌棒；此外，当排场下地时，黑木耳菌棒在露天条件下出耳，气温较高，菌棒内温度升高，造成菌丝高温烧菌，导致菌丝抗病能力下降或造成菌丝死亡，高温高湿条件下，菌棒表面或菌棒底部水分过高，竞争性真菌病害侵染培养料，然后迅速蔓延侵染整个菌棒。

2.2 黑木耳病原菌分离

从每个染病黑木耳耳片或菌棒中各分离出1个病原菌，编号为AHD-01～AHD-09。分离情况详见表2、图2、图3。

图2 病原细菌菌落形态Fig.2 Colony morphology of pathogenic bacteria

图3 病原真菌菌落形态Fig.3 Colony morphology of pathogenic fungi

表2 黑木耳病原菌分离情况Tab.2 Isolation of pathogenic bacteria from Auricularia heimuer

由表2、图2、图3可知，从西邑、芒宽2个采集地点采集的9个病害样品中分离到9株病原菌菌株，黑木耳耳片烂耳病害分离得到病原细菌菌株AHD-01，从菌落形态特征来看初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus） 细菌[10]。黑木耳菌棒感染、烂棒病害分离得到8株病原真菌。其中菌株AHD-02、AHD-03、AHD-06从菌落形态特征来看初步鉴定为木霉属（Trichoderma） 真菌[11]，菌株AHD-04、AHD-08初步鉴定为镰刀菌属（Fusarium） 真菌[12-14]。结合AHD-05菌株菌落形态特征和图1-5子实体形态，初步鉴定为蜡孔菌属（Ceriporia） 真菌[15]。AHD-07初步鉴定为节丛孢菌属 （Arthrobotrys） 真菌[16]。AHD-09初步鉴定为耙齿菌属（Irpex） 真菌[17]。

2.3 基于rDNA序列的病原菌系统发育分析

将病原菌菌株AHD-01的16S rDNA序列在GenBank中进行序列Blast分析，获取同源性较高的序列构建系统发育树，确定该菌株的系统发育地位，详见图4。

由图4可知，菌株AHD-01与东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis） 聚为一类，通过DNAMAN进行同源性对比对，该菌株与菌株Bacillus toyonensis（MG574860.1） 同源性达 99.51%，因此将该病原菌菌株AHD-01鉴定为东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）。

将 AHD-02、 AHD-03、 AHD-04、 AHD-05、AHD-06、AHD-07、AHD-08、AHD-09八个病原菌菌株的ITS序列在GenBank中进行序列Blast分析，获取同源性较高的序列构建系统发育树，确定该菌株的系统发育地位，详见图5。系统发育树分析结果见下表3。

表3 基于ITS序列系统发育树分析表Tab.3 Phylogenetic tree analysis table based on ITS sequences

图4 基于16S rDNA序列构建的NJ系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

图5 基于ITS序列构建的NJ系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由图5和表3可知，AHD-02和AHD-03为侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola）。AHD-04为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。AHD-05为撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）。AHD-06为长枝木霉（Trichodermacf.longibrachiatum）。AHD-07为圆锥节丛孢菌（Arthrobotrys conoides）。AHD-08为亚粘团镰孢菌（Fusarium subglutinans）。AHD-09为白囊耙齿菌 (Irpex lacteus）。

3 结论与讨论

3.1 结论

云南黑木耳排场出耳管理阶段常见病害症状主要是耳片烂耳和菌棒感染，主要发生在刺孔后、下地排场后或采收第一潮耳后。气温升高、湿度增大，起初菌棒无明显现象，后菌棒变软，表面逐渐被感染，迅速蔓延至整个菌棒。病害发生原因为菌棒刺孔后菌丝呼吸作用加强或露天出耳，温度较高，菌棒内料温升高，造成高温烧菌，使菌丝抗病能力下降或造成菌丝死亡，竞争性真菌迅速蔓延侵染整个菌棒；露天出耳时，温度过高，喷水过多或雨天湿度过大，耳片变软，易被细菌性病原菌侵染导致烂耳。

通过对分离的病原菌进行rDNA序列分析表明，导致黑木耳烂耳的病原菌AHD-01为东洋芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）。导致菌棒感染的病原菌AHD-02和AHD-03为侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola），AHD-04为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），AHD-05为撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata），AHD-06为长枝木霉 （Trichodermacf.longibrachiatum），AHD-07为圆锥节丛孢菌（Arthrobotrys conoides），AHD-08为亚粘团镰孢菌（Fusarium subglutinans），AHD-09为白囊耙齿菌 (Irpex lacteus）。

3.2 讨论

闫宝松等[18]研究表明，高温、高湿通风不良造成的细菌感染是导致烂耳的主要原因之一，本研究中发现高温、高湿引起黑木耳烂耳的病原菌为东洋芽孢杆菌 （Bacillus toyonensis）。颜一红[19]、刘正慧[20]、曹现涛[21]、崔红丽[22]等研究表明，木霉属的侧耳木霉（Trichoderma pleuroticola）、长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum），节从孢属（Arthrobotrys）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum） 是食用菌中主要病原真菌，在食用菌生产中易侵染菌棒导致烂棒，在香菇、木耳、平菇、杏鲍菇等食用菌栽培中极易发生，这与本研究中的结果一致。

本研究中，发现黑木耳菌棒受到撕裂蜡孔菌（Ceriporia lacerata）、白囊耙齿菌 （Irpex lacteus） 侵染后形成厚厚菌皮，这2种病原菌均为大型真菌，多生长于阔叶树倒木、枯立木、枯枝上。本研究中黑木耳栽培样地周围均是森林，可能是黑木耳高温烧菌后菌丝生长较弱或死亡，四周环境中的病原菌孢子侵染菌棒造成病害。前人研究表明，撕裂蜡孔菌能分泌药物成分，可用于预防和治疗贫血、糖尿病、胃病、癌症和心脏病等疾病，还能用于生物造纸、农药降解、废水处理等，开发潜力巨大[23-28]。白囊耙齿菌制成的药物制剂能明显抑制慢性肾炎病人的红细胞及尿蛋白，是一种极具有市场开发潜力的抗肾炎药物。因此，本研究中分离获得的撕裂蜡孔菌、白囊耙齿菌菌株可为后期菌种开发利用提供种质资源。