许 静， 李 姗， 蔡俊玮， 黄成虎， 龚 丽， 李 敏， 李雪锋

Graves病(Graves′ disease,GD)是一种自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)[1]。由于目前的治疗方法均不能针对其病因进行治疗，故复发率高。因此，有必要进一步探索GD的病因及发病机制。微小RNA-146a(micro-RNA-146a，miR-146a)与免疫反应有关的靶mRNA包括白细胞介素1受体相关激酶1/2(interleukin-1 receptor-associated kinase 1/2，IRAK1/2)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF-6)、白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、CC趋化因子配体5/8[chemokine(C-C motif) ligand 5/8，CCL5/8]和Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD)等[2-6]。本研究通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测初发GD患者与正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miR-146a及其与免疫相关的靶mRNA的表达情况，旨在从转录后水平初步探讨miR-146a及其靶mRNA与初发GD的相关性。

1 对象与方法

1.1对象 收集2017年9月-2018年8月就诊的初发GD患者30例，男性9例，女性17例，年龄(34.30±11.87)岁(16～62岁)。入选标准：(1)有甲状腺功能亢进(甲亢)的高代谢症状和体征；(2)触诊和B超均证实甲状腺弥漫性肿大；(3)血清游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(free tetraiodothyronine，FT4)、总三碘甲状腺原氨酸(total triiodothyronine，TT3)、总四碘甲状腺原氨酸(total tetraiodothyronine，TT4)均升高，促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)降低；(4)突眼或促甲状腺激素受体抗体(thyrotropin receptor antibody，TRAb)阳性；(5)年龄14～70岁，性别不限；(6)未进行任何抗甲亢治疗；(7)近期无感染史；(8)无甲状腺危象、甲亢心、淡漠型甲亢、T3型甲状腺毒症、妊娠期甲亢等特殊临床表现及并发症；(9)无其他严重器质性疾病或慢性病史。

同期招募年龄、性别与GD组相匹配的来自体检中心的健康志愿者26例作为对照组，男性9例，女性17例，年龄(38.40±15.31)岁(18～69岁)。入选标准：(1)血常规、肝肾功能、甲状腺功能及促甲状腺受体抗体均正常；(2)无自身免疫性疾病家族史和严重器质性疾病；(3)近期无感染史；(4)未使用任何影响免疫功能的药物。所有患者和志愿者标本采集前均被告知，并签署知情同意书。两组的一般临床资料见表1。

1.2方法

1.2.1主要试剂及仪器 (1)试剂：人外周血淋巴细胞分离液(LTS1077，中国天津灏洋华科生物科技有限公司)；Trizol试剂(15596018，美国Invitrogen公司)；mRNA荧光定量PCR相关试剂(FSQ-301和QPS-201，日本TOBOYO公司)；miRNA荧光定量PCR相关试剂(KR211，FP411和E132-01A，中国TIANGEN公司)；实验所需mRNA引物采用Primer 5软件设计，miRNA引物由上海生工总公司在线设计，所有引物均由上海生工武汉分公司合成(表2)。(2)仪器：超净工作台(SW-CJ-1FD，中国AIRTECH公司)，PCR仪(C1000 TouchTM)及凝胶成像仪(1708195)(美国BIO-RAD公司)，实时荧光定量PCR仪(QuantStudio5，美国ABI公司)。

表1 研究对象的一般临床资料

TSH：促甲状腺激素；FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离四碘甲状腺原氨酸；TT3：总三碘甲状腺原氨酸；TT4：总四碘甲状腺原氨酸；TRAb：促甲状腺激素受体抗体. TRAb取值上限为30. 与对照组比较，☆☆：P<0.01.

1.2.2标本预处理 收集研究对象清晨空腹新鲜EDTA-K2抗凝静脉血10 mL，20 ℃，2 000 r/min离心20 min，分离血浆备用，加入0.01 mol/L的PBS(DEPC水配制并高压灭菌)，于剩余血细胞中稀释补足至总体积20 mL，并上下颠倒充分混匀，按LTS1077说明书采用密度梯度离心法分离，获得较纯的PBMC，加入1 mL Trizol试剂，混匀，室温下裂解5 min，转移至新的无RNA酶的1.5 mL EP管中，并置于-80 ℃冰箱保存，以备提取RNA之用。

1.2.3提取PBMC总RNA 取出用Trizol均质化的PBMC，室温融化后按Trizol试剂说明书提取总RNA。用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度，确保OD260/280为1.8～2.0。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，要求凝胶图谱中显示28S，18S及5S 3条带。检测合格的产品立即进行逆转录或置于-80 ℃冰箱备用。

表2 PCR引物序列

1.2.4miR-146a相对表达水平检测 按KR211说明书将检测合格的含有miRNA的总RNA先采用加尾法逆转录成cDNA；然后以U6为内参，以RNase-Free水代替cDNA作为阴性对照，按FP411说明书进行荧光定量PCR反应检测miR-146a的相对表达量。所有反应(包括阴性对照)均设有3个复孔以保证实验的重复性。逆转录及荧光定量PCR反应体系见表3。miRNA逆转录的反应条件：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min；荧光定量PCR的反应条件：95 ℃ 15 min→5×(94 ℃ 20 s→64 ℃ 30 s→72 ℃ 34 s)→40×[94 ℃ 20 s→60 ℃ 34 s(该过程收集荧光信号)]→溶解曲线分析。

1.2.5miR-146a靶mRNA的相对表达水平检测 按照FSQ-301说明书将总RNA中的mRNA逆转录成cDNA(以5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control代替5×RT Master Mix Ⅱ作为阴性对照)。然后以β-actin为内参，以RNase-Free水及加入5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control的逆转录反应液代替cDNA作为阴性对照，按照说明书进行荧光定量PCR检测靶mRNA表达。所有反应(包括阴性对照)均设有3个复孔以保证实验的重复性。反应体系见表3；反应条件如下：mRNA逆转录反应条件为RNA变性(65 ℃ 5 min→立即置于冰上冷却)→去除基因组DNA(37 ℃温育5 min→立即置于冰上冷却)→逆转录反应(37 ℃ 15 min→50 ℃ 5 min→98 ℃ 5 min→4 ℃ hold)。荧光定量PCR反应条件为95 ℃ 1 min→40×(95 ℃ 15 s→延伸45 s)→溶解曲线分析。延伸温度可根据mRNA引物做适当调整，延伸阶段采集荧光值。

表3 miRNA或mRNA的逆转录及荧光定量PCR反应体系

1.2.6RT-PCR相对定量基因表达数据分析 采用软件SDS Relative Quantifacation 7500 software v2.1(美国Applied Biosystems公司)自动计算RT-PCR相对定量表达的平均Ct值及阈值，采用2-ΔΔCt法计算分析各检测基因的相对表达量。

1.2.7甲状腺功能及TRAb测量方法 采用化学发光法进行检测。各指标的正常值范围分别是：TSH 0.4～5.0 mIU/L，TT3 0.95～2.60 nmol/L，TT4 0.73～84 nmol/L，FT3 2.76～7.65 pmol/L，FT4 10.29～25.70 pmol/L，TRAb 0～1.5 IU/L。

2 结 果

2.1PBMC中miR-146a及其靶mRNA的相对表达水平比较 与对照组比较，初发GD患者的PBMC中，miR-146a，TRAF-6和CCL5的相对表达量显著下降(P<0.01)；IL-8和CCL8的表达水平显著上升(P<0.05)；IRAK1，IRAK2及FADD的表达水平差别则无统计学意义(P>0.05)，具体见表4。

表4初发GD和正常人PBMC中miR-146a及其靶mRNA的相对表达水平

Tab 4Relative expression levels of miR-146a and its target mRNA in PBMCs in primary GD patients and healthy controls

检验指标对照组初发GD组miR-146a1.01±0.34 0.67±0.19☆IL-80.75(0.30～2.90)2.20(2.04～2.83)☆IRAK11.18(0.45～2.37)0.98(0.74～1.42)IRAK20.99(0.66～1.27)0.81(0.73～0.96)TRAF-61.05±0.340.67(0.53～0.82)☆FADD1.07±0.41 0.94±0.30CCL51.22±0.990.64(0.40～0.86)☆CCL80.85(0.46～3.49)1.90(0.74～5.11)☆

GD:Graves病. 与对照组比较，☆：P<0.01.

2.2miR-146a表达水平与IL-8及CCL8相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，miR-146a表达水平与IL-8显著负相关(r=-0.294，P<0.05)，与CCL8也呈负相关(r=-0.298，P<0.05)。

2.3miR-146a与IL-8及CCL8的mRNA和各临床因子间相关性分析 Spearman相关性分析显示，miR-146a，IL-8及CCL8与临床指标(TSH，TT3，TT4，FT3，FT4，TRAb)间具有明显相关性(表5)。miR-146a表达水平与TSH水平呈正相关(P<0.01)，与TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb呈负相关(P<0.05)。IL-8和CCL8的mRNA表达水平与TSH水平呈负相关(P<0.05)，与TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb水平呈正相关(P<0.01)。

表5 miR-146a与IL-8及CCL8水平和临床各因子间相关性分析

TSH：促甲状腺激素；FT3：游离三碘甲状腺原氨酸；FT4：游离四碘甲状腺原氨酸；TT3：总三碘甲状腺原氨酸；TT4：总四碘甲状腺原氨酸； TRAb：促甲状腺激素受体抗体.

3 讨 论

GD是最常见的甲亢，以产生自身抗体TRAb而使促甲状腺激素分泌过多导致甲亢、弥漫性甲状腺肿和Graves眼病(Graves ophthalmopathy，GO)等为特征，严重者甚至可因诱发甲亢危象或甲亢心而死亡[7]。虽然通过现有临床表现、甲状腺功能和TRAb已可对GD做出诊断，诊断价值已很高，但是仍然有必要进一步研究探索GD的病因和发病机制。

miR-146a是重要的免疫调节分子，可通过抑制其靶mRNA的表达或翻译成蛋白质而在TLR-NF-κB信号通路、FADD介导的细胞凋亡通路以及RIG-1-I型干扰素途径等信号途径中发挥免疫应答调节作用，从而参与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、干燥综合征(sjogren syndrome，SS)、1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)等多种自身免疫性疾病的发病过程，且其表达水平及所调控的靶mRNA在不同疾病中存在差异[2,6,8-12]。而高通量测序技术发现，miR-146a在GD的不同组织中均存在差异性表达现象[13-18]。故推测miR-146a可通过差异性表达及调控不同的靶mRNA而在GD中发挥作用。

既往研究显示，miR-146a在PBMC中的表达情况存在争议。杨文娟等研究发现，miR-146a在GD的PBMC中表达量降低[18]；但Otsu等研究认为，miR-146a在GD的PBMC中表达量增加[13]。本实验显示，初发GD的PBMC中miR-146a表达量降低，与杨文娟等的研究结果一致。进一步分析发现，Otsu等只纳入了经甲巯咪唑治疗后的缓解期GD和TRAb至少5年仍阳性的顽固性GD患者，并未纳入未进行抗甲状腺治疗的初发GD患者；而杨文娟等纳入的研究对象与本研究的实验组纳入标准一致，均为未经治疗的初发GD患者，且本实验结果证实了杨文娟等的结论，并进一步发现miR-146a的表达水平与TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb水平呈显著负相关，与TSH水平呈显著正相关。同时研究表明，miR-146a在初发GD患者的甲状腺组织、血清中的表达量也降低[15，17]。故推测不同组织中表达量降低的miR-146a可能在初发GD中发挥了重要作用，而抗甲状腺药物治疗GD的机制可能涉及到增加miR-146a的表达量。

既往对GD的研究并未涉及到miR-146a免疫相关性靶mRNA在GD中的表达情况。本研究进一步测定了初发GD患者PBMC中IRAK1/2，TRAF，IL-8，CCL5，FADD及MCP2的mRNA的表达水平，结果显示，初发GD患者PBMC中IL-8和CCL8表达量升高，与miR-146a的表达水平趋势相反，且呈显著负相关。推测miR-146a可能通过负性调控IL-8和CCL8的表达水平而在初发GD中发挥作用。

IL-8和CCL8均属于趋化因子家族成员。IL-8即CXC趋化因子配体8[chemokine( C-X-C motif) ligand 8，CXCL8]，在炎性细胞趋化、血管生成、有丝分裂和细胞增殖中发挥正向调节作用[19]。既往研究表明，GD患者血清miR-146a的表达水平下降[17,20]，IL-8水平升高，并与TRAb呈正相关[21]；GO患者脂肪细胞和眼眶成纤维细胞中miR-146a表达量增高[22-23]，人源性单克隆抗IGF-1R阻断抗体——Teprotumumab可通过显著性抑制IL-8的mRNA表达而抑制眼眶成纤维细胞中IGF-1诱导的免疫炎症反应[24]。CCL8又称为单核细胞趋化蛋白2( monocyte chemotactic protein 2， MCP2)，属于CC家族成员，可通过与CCR1，CCR2，CCR3，CCR5及CCR8等结合，从而在炎症反应、肿瘤免疫等中发挥作用[25]。例如，有研究发现，HIV-1感染后的人脑小胶质细胞中高表达的miR-146a可抑制CCL8的表达，从而抑制CCR5介导的HIV-1感染[4]。本实验结果显示，GD患者PBMC中IL-8和CCL8的mRNA表达水平升高，并与血清TSH呈负相关，与TT3，TT4，FT3，FT4及TRAb呈正相关。故推测低表达的miR-146a可通过靶向升高IL-8和CCL8的mRNA的表达而在炎性细胞趋化、细胞增殖以及血管生成等方面发挥促进作用，从而导致弥漫性甲状腺肿和自身免疫性炎症反应，但具体机制有待于进一步阐明。

同时，本研究发现，初发GD患者PBMC中TRAF-6和CCL5的mRNA表达量降低，与miR-146a的表达水平趋势一致，且IRAK1/2和FADD水平与对照组之间无明显差异。这些结果与miR-146a及其靶mRNA在其他自身免疫性疾病(如SS)的PBMC中的表达结果不同[17]，进一步证实了miR-146a可能通过差异性表达及调控不同靶mRNA而参与不同自身免疫性疾病的发病机制这一观点。但目前并不能说明这些靶mRNA与初发GD无关，因为miR-146a还可能通过抑制这些mRNA翻译成蛋白质而参与GD的发病，或者还有其他miRNA参与了对这些靶mRNA的表达调控，下一步实验可通过测定GD患者与正常人PBMC中这些靶蛋白的表达量以及其他与这些靶mRNA相关的miRNA的表达量而进一步阐释该观点。

总之，本实验结果表明，miR-146a与GD的发生密切相关，其可能通过抑制其靶基因IL-8和CCL8的mRNA的表达而参与GD的发病，虽然其诊断价值不大，但其表达水平未来可能作为预测GD发生的辅助潜在生物学指标，未来也有可能成为治疗GD的生物学靶点。但由于样本量有限，还未能完全阐明其具体作用机制，有待于进一步研究。