何 磊，陈 欣，唐建军

基于稳定性同位素的有机质分解测定在生态学实验教学中的应用

何 磊，陈 欣，唐建军

（浙江大学 国家级生物实验教学示范中心，浙江 杭州 310058）

稳定性同位素技术是生态学的重要研究手段，该文将稳定性同位素技术应用于生态学开放实验教学，设计了基于稳定性同位素的有机质分解测定实验。该实验探究性强，学生参与度高，拓宽了学生对生态学研究方法的认知，有助于学生了解稳定性同位素技术在生态学研究领域中的应用，同时大大提高了学生设计、参与相关生态学实验的能力。

稳定性同位素；有机质分解；生态学实验教学；稳定性氮同位素；稳定性碳同位素

土壤有机质是一种复杂的混合物，包括单分子物质如氨基酸、单糖等，多分子物质如纤维素、蛋白质、木质素等，以及植物残体和微生物残留物等，是植物养分的主要来源之一[1-3]。土壤碳氮是全球碳氮循环的一个重要组成部分[4-5]，土壤所贮存的碳含量达到地球植物和大气总和的2倍[6]，土壤中能被植物直接吸收的氮主要包括NH4+-N和NO3--N、有机氮和微生物氮等[5,7]。在陆地生态系统中，植物同化物主要以植物凋落物（掉落的叶片以及死根）和根系分泌物的形式进入土壤，约占植物每年生产量的90%，成为土壤分解系统中有机质的主要成分[8]。

土壤有机质的分解受到多重因素的影响，包括该地区的气候条件、土壤的理化性质、植物根系分泌物，以及凋落物成分、土壤微生物群落等[9]。另外，植物的种类和多样性也在一定程度上影响土壤有机质的分解[10]。土壤有机质的分解和复杂的转化过程是在微生物的作用下完成的，包括矿质化和腐殖化过程。了解土壤中有机质分解过程，有助于了解土壤碳动力学，从而有助于研究全球碳氮循环过程[11]。

稳定性同位素示踪技术是利用经富集的稀有稳定性同位素作为示踪剂研究相关领域科学问题的技术，包括生态学、农业科学、水文科学、地球科学等[3,12-13]。目前，稳定性同位素技术已成为生态学研究领域一项重要的研究手段，其中15N和13C稳定性同位素可以精确可靠地分析养分在迁移与转化过程中的变化，因此被广泛应用于生态系统、全球碳氮循环、农业物种互惠等方面的研究[3,12,14-15]。

基于稳定性同位素的有机质分解测定，是“生态学”实验课程中针对生态学专业本科生开设的科研训练实验，具有综合开放和注重科研思维训练的特点。本实验历时一个半月，学生通过课程学习、文献查阅、实验设计及操作、数据统计分析等，完成了较为系统的科研基础训练。实验结束后，学生共享实验数据、分组撰写实验报告，最终进行PPT总结汇报。该实验有助于学生建立科学研究思维、培养团队合作精神，并为日后进行相关科学研究奠定基础。

1 实验原理

1.1 15N的测定与计算[16]

15N的同位素值（δ）的计算公式如下：

其中，sample是样本样品的重同位素（15N）与轻同位素（14N）的丰度比；standard是标准物质（大气N2）的重同位素（15N）与轻同位素（14N）的丰度比，为固定值0.003 676 5。

1.2 13C的测定与计算

13C的同位素值（δ）的计算公式为：

其中，sample是样本样品的重同位素（13C）与轻同位素（12C）的丰度比；standard是标准物质（Pee Dee Belemnite）的重同位素（13C）与轻同位素（12C）的丰度比，为固定值0.011 237 2。

2 实验材料与仪器设备

实验材料包括：富集13C-15N的玉米叶片，尼龙膜25 μm，河沙（20~100目，粒径相似）；仪器设备包括：天平及分析天平，培养皿，玻璃棒，药匙，分解袋（需提前制作），橡皮筋，行星式球磨仪（飞驰，PULVERISETTE6），同位素质谱仪（美国，Thermo Fisher Delta V Advantage），超微量电子天平（METTLER TOLEDO XP6）。

3 实验内容与步骤

本实验以13C 和15N同位素双标记的玉米叶片作为分解材料，测定不同土壤盐分浓度（0.5‰、2‰、5‰）下植物种植与否（有柽柳、无柽柳）对土壤中有机物（玉米叶片）分解速率的影响。实验开始时将含有玉米叶片的尼龙网袋（分解袋）埋入经不同处理的盆栽土壤中，1个月后测定分解袋中13C和15N的剩余含量。

实验采用双因素完全随机实验设计，设置3个盐分梯度（0.5‰、2‰、5‰）和植物种植与否（有柽柳、无柽柳）2个因素，每个处理设置5个重复，所有盆栽完全随机放置。同时设置不埋入土中的空白对照10个，共计40个分解袋。

3.1 实验材料准备

玉米种植在温室周转箱中，玉米拔节期后向土壤中加入15N丰度为98%的硫酸铵溶液。在孕蕙期前收获叶片。将收获的玉米叶片于105 ℃下杀青15 min，再移至烘箱中65 ℃烘干至恒重。由于玉米为C4植物，其叶片自然富集13C，在生长过程中不另外加富13C。

3.2 分解袋的制备

将烘干的玉米叶片混合剪成长×宽为5 mm×3 mm的碎片，并混合均匀，保证装入每个分解袋的叶片大小、形状、分布基本一致。准确称取0.5 g碎玉米叶片和65 ℃烘干且粒径相似（20~100目）的过筛河沙25 g于培养皿中（f90 mm），并加入2 mL超纯水混合均匀。用药匙将混匀后的河沙玉米叶装入事先备好的分解袋中（分解袋裁成14 cm×14 cm大小后制袋），压实后用橡皮筋扎紧封口待用。将制作好的分解袋做好盐浓度（空白对照、0.5‰、2‰、5‰）标记和植物（空白对照、有柽柳、无柽柳）标记。

3.3 分解袋埋放

按照分解袋上的标记将分解袋分别埋放在对应处理的盆栽中，一个盆栽对应一个分解袋，并贴好标签。在盆栽土壤中挖掘直径约5 cm、深约12 cm的洞，放入分解袋，分解袋顶端距离土壤表层约5 cm，再将表层土覆盖好、压实。其余10个空白对照分解袋不埋入土中，于–40℃以下保存待用。对埋有分解袋的盆栽每周按需浇水，保持土壤湿润。

3.4 样品回收预处理与上机测定

1个月后将分解袋取出，干燥至恒重。将分解袋中的剩余样品全部取出，放入行星式球磨仪中充分研磨，然后用超微量天平称取研磨样品，利用同位素质谱仪测定同位素含量。

4 实验结果与分析

4.1 实验结果计算

同位素测定数据见图1，公式中数据由同位素质谱仪直接测得。计算分解袋中重同位素的含量[16]：

计算玉米叶片的分解率（其中ck表示对照组）：

4.2 实验结果分析

双因素方差分析表明，种植植物显著提高了玉米叶片的分解率（15N：F=9.43，<0.01；13C: F=4.94，<0.05），盐浓度对叶片分解率的影响不显著（15N：F=1.08，>0.05；13C: F=0.95，>0.05），盐浓度与植物的交互作用对分解率的影响不显著（15N：F=0.074，>0.05；13C: F=0.4656，>0.05）。其中，15N结果表明，种植植物对分解率的影响极显著（<0.01），见图2；13C结果表明，种植植物对分解率的影响显著（<0.05），见图3。

图2 不同处理下玉米叶片中15N的分解率

5 结语

稳定性同位素技术是近年来生态学科中兴起的一项新型研究手段[17]，已应用于土壤碳氮循环、生态系统食物链结构和能量流动，以及传统农业系统中资源的互补利用等研究领域[3,14-15]。

图3 不同处理下玉米叶片中13C的分解率

在生态学本科实验中，将13C、15N同位素技术用于有机质分解研究，探讨土壤中有机物质分解转化动态，是研究简单的碳氮循环过程的一个良好模型。通过该实验，学生不仅可以学习同位素质谱仪的使用方法、样品处理方法以及数据统计分析等一系列的实验操作技能，还能更直观地了解生态学相关设计思路及实验方法，锻炼实验动手能力和生态学思维能力，为今后的科研工作打下基础。该实验需要全体学生共同参与分解袋的制作、实验期间的管理、样品的预处理及最终数据统计分析等，锻炼了学生团结协作的能力，以及分析问题和解决问题的能力。此外，该实验对于进一步提高学生设计生态学相关实验能力及了解相关生态学研究方法具有重要意义。

[1] WEIL R R, MAGDOFF F. Significance of soil organic matter to soil quality and health. In: Magdoff F, Weil RR (Eds.), Soil Organic Matter in Sustainable Agriculture [M]. Boca Raton: CRC Press, 2004.

[2] 孙尚华.土壤碳、氮循环对全球环境因子变化的响应：土地利用类型、N沉积和气候变暖对土壤C、N循环的影响[D].杨凌：西北农林科技大学，2014.

[3] 田秋香，张威，闫颖，等.稳定性同位素技术在土壤重要有机组分循环转化研究中的应用[J].土壤，2011, 43(6): 862–869.

[4] JAMES TW, GEORGE A. KOWALCHUK, R A, et al. Summer warming accelerates sub-arctic peatland nitrogen cycling without changing enzyme pools or microbial community structure[J]. Global Change Biology, 2012, 18(1): 138–150.

[5] 宋长春，宋艳宇，王宪伟，等.气候变化下湿地生态系统碳、氮循环研究进展[J].湿地科学，2018, 16(3): 424–431.

[6] SCHLESINGER W H, ANDREWA J A. Soil respiration and the global carbon cycle[J]. Biogeochemistry, 2000, 48(1): 7–20.

[7] 李玉中，王庆锁，钟秀丽，等.羊草草地植被：土壤系统氮循环研究[J].植物生态学报，2003, 27(2): 177–182.

[8] GESSNER M O, SWAN C M, DANG C K, et al. Diversity meets decomposition[J]. Trends In Ecology & Evolution, 2010, 25(6): 372–380.

[9] CONANT R T, RYAN M G, AGREN G I, et al. Temperature and soil organic matter decomposition rates-synthesis of current knowledge and a way forward[J]. Global Change Biology, 2011, 17(11): 3392–3404.

[10] STEINBEISS S, BEβler H, ENGELS C, et al. Plant diversity positively affects short-term-soil carbon storage in experimental grasslands[J]. Global Change Biology, 2008,14(12): 2937–2949.

[11] CESARZ S, FENDER A C, BEYER F, et al. Roots from beech (.) and ash (.) differentiallyaffect soil microorganisms and carbon dynamics[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2013, 61: 23–32.

[12] 雷帅，何春霞，张劲松，等.稳定碳同位素技术在生态系统研究中的应用[J]. 同位素，2019, 32(1): 1–11.

[13] 张胜.同位素示踪技术的原理及应用阐释[J].生物学教学，2018, 43(8):79–80.

[14] 袁宇翔.基于C、N稳定同位素技术的兴凯湖食物网结构研究[D].长春：中国科学院大学（中国科学院东北地理与农业生态研究所），2018.

[15] 胡亮亮.农业生物种间互惠的生态系统功能[D]. 杭州：浙江大学，2014.

[16] CHENG L, BOOKER F L, TU C, et al. Arbuscular Mycorrhizal Fungi Increase Organic Carbon Decomposition Under Elevated CO2[J]. Science, 2012, 337(6098): 1084–1087.

[17] 林光辉.稳定同位素生态学[M].北京：高等教育出版社，2013.

Application of determination of organic matter decomposition based on stable isotope in ecological experiment teaching

HE Lei, CHEN Xin, TANG Jianjun

(National Biological Experimental Teaching Demonstration Center, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Stable isotope technology is an important research means of ecology. In this paper, the stable isotope technology is applied to the open experiment teaching of ecology, and the experiment of organic matter decomposition based on stable isotope is designed. This experiment has strong inquiry with high students’ participation, which broadens students’ understanding of ecological research methods, helps them to understand the application of stable isotope technology in the field of ecological research, and greatly improves their ability to design and participate in relevant ecological experiments.

stable isotope; organic decomposition; ecological experiment teaching; stable nitrogen isotope; stable carbon isotope

G642.423

A

1002-4956(2019)11-0174-03

10.16791/j.cnki.sjg.2019.11.042

2019-03-22

浙江大学通识教育改革项目（2018）；“物种多样性维持稻田系统产量和土壤肥力稳定性的生态学机理”国际合作项目（31661143001）；黄河三角洲生态环境重点实验室开放基金项目（2016KFJJ02）

何磊（1987—），女，浙江金华，博士，实验师，主要研究方向为生态学和实验室管理与建设。E-mail: helei8705@zju.edu.cn