(大连工业大学食品学院,辽宁大连 116034)

乳清蛋白膜具有黏性和伸缩性,在较低的湿度条件下具有优良的氧气和油脂阻隔性。然而由于含有较多的亲水性氨基酸,乳清蛋白膜的机械强度和水蒸气阻隔性能较差,因此利用可再生的纤维素和壳聚糖等添加入蛋白膜基质进行共混改性,对乳清蛋白膜的性能进行改良[1-2]。Yoo等[3]研究纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠分别与乳清蛋白制备复合膜,其表现出更低的透光率,更高的热稳定性,且具有与纯的蛋白膜相似的阻水特性。

应用酶法改性,也是改善蛋白质成膜性质的一种有效途径。转谷氨酰胺酶(TG)可以催化发生酰基转移反应,促进蛋白质分子间或分子内发生交联反应,从而可以改善蛋白膜的性能。韩翠萍等[7]将TG酶应用于制备乳清蛋白膜,发现TG酶显著增强了乳清蛋白膜的机械性能。

目前相关研究中关于纤维素对乳清蛋白膜的共混改性修饰和TG酶对乳清蛋白膜的改性研究较多,而利用多糖和TG酶共存条件对乳清蛋白膜性能修饰作用的研究较少。基于前期研究发现,NCC和TG酶在共存条件对乳清蛋白膜的性能具有修饰作用。本文侧重研究TG酶的添加量对WPC-NCC复合膜的机械性能和屏障性能的影响作用,并探究TG酶对WPC-NCC复合膜微观结构的影响,为TG酶交联WPC-NCC复合膜的开发应用提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清浓缩蛋白WPC-80 德国米莱乳品公司;纳米微晶纤维素水凝胶 纳米微晶纤维素,干物质含量为2% 上海开翊新材料有限公司;转谷氨酰胺酶 酶活为100 U/g蛋白江苏一鸣生物制品有限公司;甘油 天津市恒兴化学试剂公司;其他试剂 均为分析纯。

IKA RT5磁力搅拌器 德国IKA有限公司;恒温恒湿箱(KBF720) 德国Binder有限公司;质构仪(TA-XT plus) 英国Stable Micro System公司;傅里叶红外光谱仪(Spectrum 10) 美国PE公司;场发射扫描电子显微镜(JSM-7800F) 日本电子株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 复合膜制备 将乳清浓缩蛋白粉末缓慢加入一定量的纳米微晶纤维素水凝胶中,缓慢磁力搅拌2 h,避免出现气泡,使其充分溶解均匀。随后定容,使混合溶液中的蛋白终浓度为10%,NCC的干物质含量为蛋白质量的10%。分别向混合溶液中添加3、6、9、12 U/g蛋白的TG酶液,于50 ℃恒温水浴反应2 h。然后在80 ℃水浴灭酶10 min,迅速冷却至室温。最后加入45%的甘油(以蛋白质量为基准)作为增塑剂,缓慢搅拌1 h,制得均匀的混合膜液。以未加TG酶处理的复合膜液为对照。

将成膜液倒入平皿中(90 mm×90 mm),缓慢晃动平皿,使液面水平,置于恒温恒湿箱中于35 ℃,RH 40%条件下烘干,揭膜后于25 ℃、RH 50%条件回软24 h,备用。

1.2.2 厚度测定 采用均值法[8]。使用数显外径千分尺测定膜的厚度,在制备好的膜上任意选择5个点,测量厚度,取其平均值为膜的厚度。所测得膜的厚度作为机械性能和水蒸气透过率的计算依据。

1.2.3 机械性能测定 采用质构仪法[9]。根据ASTM D882-02方法,使用A/TG探头测定复合膜的抗拉强度和断裂伸长率。将膜裁剪为1 cm×4 cm的长方形膜片,初始夹距设置为20 mm,拉伸速度设置为10 mm/s,有效拉伸距离为20 mm,记录下膜样品断裂时的抗拉强度和断裂伸长率。样品断裂以在中间处断裂为准,每组样品重复测定9次。

1.2.4 透光率测定 采用分光光度计法。膜的透光率使用可见光分光光度计测定。根据Soazo等[7]方法,将膜裁剪成1 cm×4 cm的长条膜片,置于比色皿内侧,在波长600 nm下测定膜的透光值,以空皿作为对照。

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1.2.5 水蒸气透过率测定 采用拟杯子法[10]。将膜样品置于恒温恒湿箱25 ℃、RH 50%条件下24 h,达到平衡。将3.0 g无水氯化钙添加至称量皿中(直径为2.6 cm,深度为3.0 cm),用各种膜样品封盖。将称量皿放置于恒温恒湿箱(25 ℃、RH 50%)中,每隔1 h称量并记录下封膜后称量皿的质量,持续称量9 h。水蒸气透过率值的计算,参考González等的方法[11],水蒸汽传输速率以通过膜进入称量皿的水蒸汽质量相对于时间的变化绘图曲线的斜率表示。

WVT=F/A

式(1)

式中,WVT-水蒸汽传输速率;F-线性图斜率;A-暴露于蒸汽传输的面积,m2。

式(2)

式中,WVP-水蒸汽透过率,gmPa-1s-1m-2;S-在25 ℃时的饱和压力,Pa;(RH1-RH2)-杯内外部湿度差;e-膜的厚度,m。

1.2.6 红外光谱 将不同TG酶添加量的WPC-NCC复合膜分别与一定量KBr用研钵充分研磨成均匀粉末,压制成薄片。傅里叶红外光谱仪进行全波段扫描(4000～400 cm-1),扫描次数为4次,分辨率4 cm-1,平行4次。用Omnic 8.2软件在谱带范围内(酰胺I带1700～1600 cm-1)进行基线校正,并经去卷积处理,在二阶导数谱图基础上用高斯(Gaussian)曲线拟合,估算出子峰的个数和位置,调整各子峰的半峰宽。确定各子峰与各个二级结构单元的对应关系后,根据峰面积计算各二级结构组分的相对百分含量[12]。

1.2.7 扫描电镜 采用扫描电镜(SEM)观察。使用扫描电子显微镜扫描成膜的表面结构。样品剪成固定的形状粘在金箔条上,在真空的条件下对样品进行处理,加速电压为25 kV,10000倍的放大倍数下观察膜表面的微观结构。

1.3 数据处理

每组实验至少重复3次,除去失败膜的结果,试验结果主要采用软件IMB SPSS Statistics 20中Duncan检验进行差异显著性分析,P<0.05时认为差异显著。用不同字母表示复合膜性能的差异显著(P<0.05),利用软件Origin 8.5绘图报告结果。

2 结果与分析

2.1 膜的机械性能分析

抗拉强度和断裂伸长率等机械性能是探究生物材料内部结构重要的指标。包装材料应具有一定强度、韧性和延展性。如图1所示,不同TG酶添加量对WPC-NCC复合膜抗拉强度的影响。可以看出,复合膜的抗拉强度随着TG酶添加量的增加而先增大后减小。与未添加TG酶的复合膜相比,当TG酶添加量为9 U/g蛋白,抗拉强度由1.3 MPa增长至2.38 MPa,达到最大值。这是由于TG酶的加入,促使乳清蛋白发生共价交联,对复合膜的抗拉强度起到了一定的增强效果。张春红等[13]在研究TG酶改性对花生蛋白膜性能的影响中,发现了相似结果,TG酶的交联作用,使蛋白膜的拉伸强度和断裂伸长率都得到了较大程度的提高。

TG酶的添加对复合膜的断裂伸长率具有增强效果。如图1所示,随着TG酶添加量的增加,复合膜的断裂伸长率显著增大。与未添加TG酶的WPC-NCC复合膜相比,当TG酶的添加量达到12 U/g蛋白,复合膜的断裂伸长率增长了约30%。这主要由于TG酶的交联作用,在分子内和分子间形成了酰胺键,分子间作用力增强[14],从而在一定程度上提高了复合膜的断裂伸长率。这一结果与Wang等[15]研究不同添加量TG酶对明胶-碳酸钙复合膜的影响的结果相一致,研究发现不同添加量的TG酶对复合膜断裂伸长率的增长具有显著作用。

图1 TG酶对WPC-NCC复合膜机械性能的影响Fig.1 Effect of TGase on mechanicalproperties of WPC-NCC composite film注:不同小写字母代表抗拉强度差异显著(P<0.05);不同大写字母代表断裂伸长率差异显著(P<0.05)。

2.2 膜的屏障性能分析

包装材料的透光性,能够直观地反映TG酶对乳清蛋白基质膜表观结构的影响。图2为不同TG酶添加量对WPC-NCC复合膜透光率的影响。可以看出,随着TG酶添加量的增加,复合膜的透光率在一定程度上有所下降,但差异不显著。复合膜的外观没有太大的变化,呈现光滑透明的状态,复合膜在600 nm处的透光率保持在约为50%～60%。这一结果与姜燕[16]等利用TG酶对食物蛋白质成膜性能的影响相一致,姜燕等中指出TG酶可以引起乳清蛋白的聚集和交联,成膜溶液的浊度增加,从而使成膜后透光率下降。

水蒸气透过率(WVP)能够代表包装材料在包装食品与外界环境之间,阻碍水分子的迁移能力,这一特性主要由包装材料内部的微观结构所决定。图2为不同TG酶添加量对WPC-NCC复合膜的水蒸气透过率的影响。与未经TG酶处理的WPC-NCC复合膜相比,当TG酶添加量超过9 U/g蛋白,复合膜的水蒸气透过率下降。这主要由于在TG酶的诱导作用下,可以在赖氨酸和谷氨酰胺之间形成共价键,从而形成致密的网络结构[17],因此可以降低WPC-NCC复合膜的水蒸气透过率。而Oh等[18]研究表明TG酶对酪蛋白膜、乳清蛋白膜、玉米蛋白-酪蛋白和玉米蛋白-乳清蛋白膜的水蒸气透过率具有不同程度的影响,这可能由于制备方法、蛋白种类不同、以及交联程度等因素共同调控着包装材料的水蒸气屏障性。

图2 TG酶对WPC-NCC复合膜屏障性能的影响Fig.2 Effect of TGase on barrierproperties of WPC-NCC composite film注:不同小写字母代表透光率差异显著(P<0.05);不同大写字母代表水蒸气透过率差异显著(P<0.05)。

2.3 红外光谱分析

红外光谱能够表明分子中官能团的振动模式,并通过波数的变化显示分子间的相互作用。图3显示为经过不同TG酶添加量处理的WPC-NCC复合膜样品的FTIR谱图(4000～400 cm-1)。3600～3300 cm-1范围为N-H伸缩振动以及O-H伸缩振动。文献表明,当形成分子内或分子间氢键时,O-H的吸收峰向低波数移动,且与N-H的振动吸收峰重叠而峰形变宽[19-20]。由图5可见,随着TG酶添加量的增加,复合膜样品于3500 cm-1附近的吸收峰分别为:3414.65(0 U/g蛋白)、3401.93(3 U/g蛋白)、3386.86(6 U/g蛋白)、3386(9 U/g蛋白)、3370.71 cm-1(12 U/g蛋白)。表明经过TG酶的处理,复合膜可能产生较强的分子内或分子间氢键连接。

另外,波数1700～1600 cm-1范围为酰胺I区(C=O伸缩振动),这一区域主要与蛋白质的二级结构紧密相关[21]。对酰胺Ⅰ带进行去卷积和二阶导数技术处理后,叠加峰分解为9～13个子峰的高斯曲线拟合。表1是分别经过不同添加量TG酶(0～12 U/g蛋白)处理的WPC-NCC复合膜样品的二级结构含量变化,随TG酶添加量的增加,α-螺旋(1650～1660 cm-1)在二级结构中的比例显著增大(P<0.05),而β-折叠(1610～1640 cm-1,1670～1680 cm-1)和无规则卷曲(1640～1650 cm-1)的含量显著下降(P<0.05)。在不同加酶量处理的WPC-NCC复合膜中,其二级结构主要以β-转角(166～1670 cm-1,1680～1700 cm-1)和β-折叠为主,这两者主要与弱相互作用有关,如氢键、范德华力和静电相互作用等,说明弱相互作用在维持成膜结构具有很大的作用。而α-螺旋和无规卷曲(random coil)含量相对较少。α-螺旋主要与蛋白质结构的稳定性有关,而无规卷曲的含量影响着蛋白结构的有序性。TG酶的交联作用,使得α-螺旋含量升高,无规卷曲的含量下降,表明乳清蛋白的结构向稳定性和有序性变化,增强了成膜基质结构的稳定性。这一结果与图1中WPC-NCC复合膜的机械性能随加酶量的增加而显著提升密切相关。Wu等[12]研究TG酶对胶原膜的机械性能和热稳定性能,得出了相似结果,指出TG酶的交联处理使得蛋白质中的弱相互作用增强,蛋白质的无序性降低,从而使蛋白膜的热稳定性和机械性能显著提高。

表1 不同TG酶添加量的WPC-NCC复合膜的二级结构(平均值±标准差)Table 1 Secondary structure of WPC-NCC composite films with different concentrations of TGase treated(Mean±SD)

图3 不同TG酶添加量的WPC-NCC复合膜的红外光谱Fig.3 FITR spectra of WPC-NCC composite filmswith different concentrations of TGase treated

注:同列数据右上角标示不同小写字母表示二级结构含量差异显著性(P<0.05)。

2.4 扫描电镜分析

膜的各种性能,很大程度上依赖于成膜材料的分子排列规整性,分子间作用力强弱以及大分子在成膜溶液中的溶解性等[15],因此复合膜微观结构与成膜性能密切相关。不同TG酶添加量的WPC-NCC复合膜在扫描电镜10000倍下观察的结果如图4所示。经TG酶处理的WPC-NCC复合膜与未经TG酶处理的复合膜样品的表面形貌没有显著差别。在10000倍扫描电镜观察下,未经TG酶处理的WPC-NCC复合膜呈现凹凸不平,粗糙的结构,且具有大量不规则孔洞,因此WPC-NCC复合膜仍具有较高的水蒸气透过率。而随着TG酶添加量的增加,复合膜表面的孔洞数量显著减少且直径减小,这一结果与图2中水蒸气透过率随着加酶量的增加而降低密切相关。当TG酶量超过9 U/g蛋白,复合膜的结构呈现出更加致密的结构,主要由于TG酶的交联作用,使乳清蛋白生成大分子聚合物,具有一定的空间结构,因此在WPC-NCC复合膜表面呈现不均匀,不平整的结构。本研究结果与Wang等[15]在TG酶诱导明胶-碳酸钙交联膜相似,其研究中指出TG酶的交联作用,使得复合膜的表面微观结构更加致密紧凑,同时显著增加了不均匀的程度。

图4 不同TG酶添加量的WPC-NCC复合膜的电镜扫描图(×10000倍)Fig.4 SEM micrographs of WPC-NCC composite filmswith different concentrations of TGase treated(×10000)

3 结论

TG酶对WPC-NCC复合膜的的机械性能和屏障性能影响显著。当TG酶量达到12 U/g蛋白时,WPC-NCC复合膜的抗拉强度由1.78 MPa增长至2.25 MPa,断裂伸长率由56.53%增长至86.75%,水蒸气透过率由4.97×10-12gmPa-1s-1m-2降低至4.40×10-12gmPa-1s-1m-2,蛋白的二级结构向稳定有序的方向转化,复合膜的表观结构发生变化。TG酶交联WPC-NCC复合膜的研究,将拓展乳清蛋白基复合膜的开发应用。