薛振宇，崔鹏飞，谷文丽，韩舒雨，张元成，邢 鑫，彭大新，邓国华，陈化兰

(1.扬州大学，江苏 扬州 225009；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150069)

禽流感病毒(AIV)是一种单股负链分节段的RNA 病毒[1]。H4 亚型AIV 在亚洲、欧洲及北美国家中广泛流行；且宿主广泛，在野鸟和家禽中均有分布[2-6]。此外，H4 亚型AIV 的跨物种感染也偶尔发生。1999年，从患有肺炎的猪中首次分离出H4N6 亚型AIV[7]。血清流行病学显示，在美国和黎巴嫩的家禽养殖工人体内检测出了针对H4 亚型AIV 的特异性抗体[8-9]。某些H4 亚型AIV 无需事先适应便可以直接感染小鼠，具有人类受体结合特异性[5]。这表明H4 亚型AIV 对哺乳动物宿主构成潜在威胁。此外，H4 亚型AIV 可与其它流感病毒共同传播并重新配对[10]。因此，H4 亚型AIV 对家禽生产和公共健康均可能构成严重威胁。

尽管监测研究表明H4 亚型AIV 在世界范围内广泛传播，但H4 亚型AIV 的生物学特性尚未得到很好的研究。目前国内报道过的H4 亚型AIV 的NA 亚型多为 N2、N6 和 N8 亚型[11]。为了解 H4N8亚型AIV 的生物学特性，初步评价其对哺乳动物的感染致病情况，本研究对2018年从重庆分离得到的一株鸭源H4N8 亚型AIV 进行全基因组测序、遗传进化分析及BALB/c 小鼠的感染性试验，为H4 亚型AIV 的遗传进化特征及综合防控奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 病毒株及实验动物A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8) 由国家禽流感参考实验室于2018年春季分离于重庆市长寿区凤城街道黄桶湾市场，并鉴定、保存；9日龄～11日龄SPF 鸡胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；6 周龄雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 主要试剂 病毒RNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV 逆转录酶和RNA酶抑制剂购自Promega 公司；rTaqDNA 聚合酶购自北京康润诚业生物科技有限公司；PCR 产物胶回收试剂盒购自美国Omega 公司；测序反应试剂盒BigDye Terminator 3.1 购自美国ABI 公司。

1.3 病毒增殖、纯化及鸡胚半数感染量(EID50)的测定 将病毒原液用含双抗(青霉素和链霉素)的PBS 10 倍倍比稀释，接种于9日龄～11日龄SPF 鸡胚中，37 ℃孵化48 h 后收取最高稀释度最高血凝价的鸡胚尿囊液。如此纯化3 代后分装冻存于-70 ℃冰箱保存备用。将纯化后的病毒10 倍倍比稀释，每个稀释度接种 5 枚 9日龄～11日龄 SPF 鸡胚，37 ℃孵化48 h 后记录每个稀释度鸡胚的血凝阳性数目，根据Reed-Muench 方法计算病毒的EID50。

1.4 全基因组测序及遗传进化分析

1.4.1 目的片段的扩增按照病毒RNA 提取试剂盒说明书提取病毒RNA，通用引物12 bp (5'-AGC AAAAGCAGG-3')作为反转录引物，将病毒RNA 反转录成cDNA。从 GenBank 中下载 H4 亚型 AIV 的各节段序列，利用其非编码区保守区域设计引物并扩增目的片段。利用胶回收试剂盒对扩增片段纯化回收。

1.4.2 病毒全基因组序列测定及分析根据测序试剂盒BigDye Terminator 3.1 说明书对病毒各节段进行序列测定，并利用SeqMan 软件进行序列拼接。将得到的完整序列利用MEGA5.0 软件进行分析并绘制HA 基因进化树。

1.5 病毒对小鼠的感染性试验 将感染组的8 只小鼠利用干冰轻度麻醉，每只小鼠以106EID50/50 μL病毒剂量进行鼻腔接种。对照组5 只小鼠接种PBS作为阴性对照。感染后的14 d 内每日记录小鼠的体质量变化及死亡情况，其中在感染后的第3 d 随机抽取感染组3 只小鼠，取其脏器(脑、鼻甲、脾、肾、肺)并进行病毒滴定。

2 结 果

2.1 病毒全基因组序列测定及进化分析 对病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)的全基因组测序，利用SeqMan 软件对测序结果进行拼接。将得到的完整序列利用NCBI 进行Blast 比对，得到与病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)基因节段同源性最高的病毒。除NA 和NS 基因与H3N8 流感病毒同源关系密切以外，其余节段来源均不同(表1)。

表1 与病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)各基因节段核苷酸同源性最高的病毒株基因Gene PB2 PB1 PA HA NP NA M NS最高同源性病毒株Highest homologous strain A/bean goose/Hubei/SZY200/2016(H11N9)A/chicken/Japan/AQ-HE144/2015(H5N6)A/wild goose/Dongting lake/121/2018(H6N2)A/duck/Mongolia/OIE-7438/2011(H4N6)A/chicken/Ganzhou/GZ157/2016(H3N2)A/muscovy duck/Vietnam/LBM529/2013(H3N8)A/pigeon/Guangxi/128P9/2012(H3N2)A/muscovy duck/Vietnam/LBM240/2012(H3N8)同源性%Homology%98.4 97.1 98.9 96.7 98.1 98.2 99.0 99.0登录号Accession No.KX121185.1 LC208495.1 MH727479.1 AB701294.1 KY415766.1 AB916669.1 KT022292.1 AB786919.1

2.1.1 HA基因序列特殊位点及其进化分析A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)分离株 HA 基因编码区全长1 695 nt，共编码565 个氨基酸。HA 蛋白裂解位点的氨基酸序列为338PEKASR↓GLF346，只有一个碱性氨基酸，符合低致病性AIV (LPAIV)的分子特征。其具有6 个潜在的糖基化位点，分别为 ：18NYT20、34NGT36、178NLT180、222NQT224、310NIS312、497NGT499。除了497NGT499位于HA2 亚基以外，其余5个均位于HA1 亚基。进化分析结果显示病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)属于欧亚分支，与病毒 A/duck/Mongolia/OIE-7438/2011(H4N6)的 HA基因同源性最高，同源性为96.7 % (图1)。表明该病毒的HA 基因可能与病毒A/duck/Mongolia/OIE-7438/2011 (H4N6)的HA 基因具有较近的亲缘关系。

2.1.2 NA基因序列特殊位点及其进化分析A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)分离株NA 基因编码区全长1 413 nt，共编码470 个氨基酸，NA 蛋白茎部无缺失且具有6 个潜在的糖基化位点，分别为46NET48、54NET56、88NNT90、148NGT150、272NFS274、297NWT299。NA 基因与病毒 A/muscovy duck/Vietnam/LBM529/2013 (H3N8)的 NA 基因同源性最高，达98.2 % (表1)。表明该病毒的NA 基因可能与病毒A/muscovy duck/Vietnam/LBM529/2013(H3N8)的NA基因具有较近的亲缘关系。

2.1.3 内部基因序列特殊位点分析及其进化分析碱性聚合酶蛋白2 (PB2)中T271A、E627K 和D701N 的突变对哺乳动物流感病毒的毒力和传播起重要作用[12-13]，病毒 A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)的 PB2 蛋白未出现以上突变。PB1 蛋白中与毒力相关的氨基酸位点Y436H 未发生突变。M2 蛋白并未出现抗金刚烷胺药物的氨基酸位点S31N 的突变[14]。NS1 蛋白存在与增强小鼠致病性相关的特殊氨基酸位点42S 和149A[15]，表明其具有增强对小鼠致病力的能力。序列分析结果显示病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)的内部基因分别与 H11N9、H5N6、H6N2、H3N2 和H3N8 具有较高同源性(表1)，其中酸性聚合酶蛋白(PA)基因与野鸟源病毒A/wild goose/Dongting lake/121/2018 (H6N2)亲缘关系密切，表明其基因来源广泛。

2.2 病毒对BALB/c 小鼠的感染性试验 将病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)以 106EID50/50 μL剂量对BALB/c 小鼠进行鼻腔接种，在接种后的14 d观察期内未见到小鼠出现任何明显的临床症状，感染组小鼠体质量也与对照组无明显差异(图2)，表明感染组小鼠呈现低致病性特征。脏器滴定结果显示，病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018 (H4N8)在小鼠鼻甲和肺脏中均可以有效复制，病毒滴度分别为2 log10 EID50/mL 和 3.33 log10 EID50/mL，但在脑、脾及肾中均未检测到病毒的复制(图3)，表明其具有感染哺乳动物的潜力。

3 讨 论

由于AIV 的人畜共患性质，如何对该病预防和控制受到广泛密切关注。2013年在中国暴发的H7N9 人类感染事件说明LPAIV 也会导致人类严重感染，甚至死亡。因此，加强对LPAIV 的关注是至关重要的。本研究对2018年春季从我国重庆分离得到的一株鸭源H4N8 亚型AIV 进行了部分生物学特性分析。其遗传演化分析结果表明，该病毒基因来源广泛，除了 NA 基因及 NS 基因与 A/Muscovy duck/Vietnam/LBM240/2012(H3N8)的同源关系密切以外，其余节段的来源均不同。其中PB2 基因、PB1基因和PA 基因分别与H11N9、H5N6、H6N2 流感病毒同源关系密切，核蛋白(NP)基因和基质蛋白(M)基因与H3N2 流感病毒同源关系密切，可见其遗传多样性。并且该病毒的8 个基因节段的宿主来源丰富，有家禽及野禽，也有水禽及陆生禽类，可见该病毒的重组情况复杂，也为其他病毒的重组提供了更多可能。特殊位点结果显示，病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8) HA 蛋白裂解位点处只具有一个碱性氨基酸，表明其具有LPAIV 的分子特征。NA 蛋白茎部缺失对病毒的复制和致病力具有一定的影响，该病毒没有发生NA 蛋白的茎部缺失。PB2 基因中的T271A、E627K 和D701N 的突变能够增强AIV 在哺乳动物中的毒力和传播能力，病毒A/duck/Chongqing/S1238/2018(H4N8)在这些位点均无突变，表明其并不具备增强AIV 在哺乳动物中致病力的能力。除NS1 蛋白上具有增强对小鼠感染能力的特殊位点42S 和149A 外，其余蛋白均不具备增强病毒毒力的位点。小鼠感染性试验结果显示，病毒可以在小鼠的鼻甲及肺中有效的复制，可见其具备感染哺乳动物的潜力。感染后小鼠并未出现明显的临床症状，且体质量变化与对照组无明显差异，表明该病毒对小鼠呈现低致病性特征。有研究报道过H4N8病毒在小鼠的肺内传代至第11 代时会对小鼠表现出很好的适应性及高致病性[16]，可见该亚型病毒虽然呈现低致病性，但却不仅可以感染哺乳动物，而且具有对哺乳动物表现出高适应性及高致病性的潜在危险，所以对LPAIV 的持续跟踪监测显得非常必要。

H4N8 亚型AIV 在亚洲国家很少被分离到，可能由于监测力度还不够，也有可能因为该亚型病毒近期才被引入亚洲地区，所以该亚型病毒可能正在扩大流行区域。有研究发现从北海道东部的滨鸟中分离出的H4N8 亚型AIV 可以引起禽类严重的呼吸系统疾病，甚至导致小鼠死亡[2]。可见该亚型AIV不仅可以感染禽类，还可以跨物种感染哺乳动物，所以H4 亚型AIV 的潜在危害不容忽视。新型流感病毒一般是由基因重排引起的，而H4 亚型AIV 基因节段来源广泛，具有遗传多样性，可能更易发生基因重排，并为其他亚型AIV 提供基因片段。若是宿主混合感染LPAIV 和HPAIV，可能会改变HPAIV 的生物学特性，增加对该病的防控难度[17]。因此，加强对H4 亚型AIV 的研究显得尤为重要。