穆国冬 张忠湛 卢松岩 王晋 任锐

摘 要 在奶牛场中作为常见、危害最大的一种疾病为奶牛乳腺炎，由此会导致产乳量不断降低，还会对乳品质造成严重影响，尤其是隐性乳腺炎，因在临床上变化不明显而很难被发现。由于长期使用药物治疗，促使致病菌产生的耐药性很强，如大环内酯类、氨基糖苷类、青霉素类、头孢类、喹诺酮类药物。为帮助兽医做好临床用药工作，可对奶牛乳腺炎病原菌开展体外抑菌试验。

关键词 奶牛乳腺炎病原菌；耐藥性分析；思路总结

奶牛乳腺炎作为一种比较常见的奶牛疾病，会影响奶牛产奶量，导致奶牛养殖经济效益不断降低，会丧失泌乳功能而被迫淘汰奶牛，且会对牛奶品质造成影响，不利于人们的身体健康。根据研究发现，该病的发生率大约控制在25-60%之间，每年所造成的经济损失高达20亿美元。这类疾病的产生与多种非特定病原微生物感染有关，根据种类可分为四种，包括80多种病原微生物，其中23种最为常见，但是主要是细菌，如链球菌、大肠杆菌等，会对乳房造成直接感染。通过对病原菌分布地域的了解，便于更好的做好疾病诊治工作[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

使用细菌基础与鉴别培养基、生化试验用培养基。取32个规模化奶牛场的牛奶样品，采样之前需使用消毒液对乳头进行擦拭，不用头两把乳汁，然后使用无菌试管取5-10ml乳汁送检。

1.2 病原菌分离培养

在血琼脂平板上接种所采集的无菌样品，在37摄氏度温度下进行18-24小时的培养，选择可疑菌落开展涂片、革兰氏染色处理，镜检后进行分离培养[2]。

1.3 分离菌的鉴别培养与形态观察

在各种培养基上分别接种可疑菌落，如SS琼脂培、伊红美兰、三糖铁斜面以及Baird-parker等鉴别培养基中，同样在37摄氏度下培养18-24小时。采用常规方法做好涂片、革兰氏染色和镜检操作，对菌落形态与培养基颜色变化进行密切观察[3]。

1.4 API鉴定试验

分离菌通过24小时的血平板纯培养之后，需严格根据操作要求在API细菌鉴定试剂条上分别接种，在37摄氏度湿盒内进行18-24小时的培养，试剂加入以后进行认真观察，并将结果准确记录下来。

1.5 Vitek-32细菌鉴定试验

对分离菌开展血平板纯培养24小时，根据要求分别接种在VITEK细菌鉴定卡上，设置培养箱温度为37摄氏度，然后进行为期18-24小时的培养，关于结果需使用计算机每小时分析一次。

1.6 药敏试验

在合适的培养基琼脂培平板上接种各细菌纯培养物涂片，然后对各种药敏纸片进行均匀放置，在选择24h、48h时间点将各药敏片抑菌圈大小记录下来。

2 结果

2.1 培养特性与生化鉴定

在SS琼脂、伊红美兰培养基中分别接种革兰氏阴性球菌，通过一段时间的培养后对菌落形态进行认真观察。取伊红美兰上黑色带有金属光泽的单菌落、白色半透明细小菌落，在三糖铁斜面上进行穿刺接种，关于初步生化鉴定需严格根据常规方法操作。

早Baird-parker培养基中接种革兰氏阳性葡萄球菌，观察菌落形态。取中心黑色，对于周围的透明袋单菌落开展血浆凝固酶试验，若结果为阳性可初步鉴定为金黄色葡萄球菌。

在分离鉴定病原菌的过程中可见比较纯的酵母样菌落，通过涂片染色进行镜检，也会发现卵圆形酵母菌样微生物，可初步鉴定为酵母菌[4]。

2.2 API或Vitek-32鉴定结果

采用API 20E或Vitek-32来鉴定开展生化试验较难的菌株，葡萄球菌的检出率最高，其中金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌最高，其次为链球菌、停乳与乳房链球菌，再次为革兰氏阴性杆菌（大肠杆菌、肺炎/溶血巴氏杆菌）。

2.3 药敏试验

研究发现，病原微生物金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌等为主要的病原菌，因此可针对性选择14种药物开展药敏试验。结果可知，所分离株经常使用的抗菌药物会产生较强的耐药性，如复合磺胺、青霉素、链霉素等，同时类似于恩诺沙星、氧氟沙星等新型抗生素同样也会产生一定的耐药菌株。

3 讨论

通过对32个规模化奶牛场的奶羊开展细菌分离鉴定，结果可知该地区的奶牛乳腺炎主要是葡萄球菌感染，这符合国内其它省市和国外的报道。同时，发现了少数酵母菌，且是临床型乳腺炎，而酵母菌所造成的奶牛乳腺炎少之又少，究其原因在细菌性乳腺炎治疗过程中因抗生素的大量反复使用有关，由此导致乳区微生物生态失衡，大量繁殖这类真菌。研究发现，本次分离所分离出来的酵母菌均不敏感应用的全部抗生素，为此必须引起临床的高度重视。

纵观流行病学的调查结果可知，临床型乳腺炎奶牛的表现以乳房炎症反应为主，如发病、疼痛、肿胀、触诊肿块等，严重者会出现全身症状、乳汁不正常，存在不同程度的凝块、絮片，重者会出现黄色浆液性物质。同时，疾病的产生受各种因素的影响，如环境卫生、饲养管理、季节、胎数、泌乳月等，其中发生率最高的当属第三季度、三胎，头胎发生率低；牛易感性最强的泌乳月当属3-4月、第9月[5]。

根据药敏试验结果，对于临床经常使用的抗菌药物所分离菌株所产生的耐药性较强，且抗生素残留会造成较大的食品安全隐患，为此人们需高度重视抗生素滥用，在免疫预防时积极的接种疫苗。但是，基于乳腺病原比较复杂，不利于有效的研制与选择疫苗，为此在今后的工作中应该重视消毒、饲养管理共组，对疫苗、抗生素进行正确合理的选择，制定综合防治措施积极有效的预防奶牛乳腺炎。

参考文献：

[1]王丹，杨峰，李新圃，罗金印，刘龙海，张哲，张亚茹，李宏胜.江苏部分奶牛场乳腺炎病原菌的分离鉴定、耐药性及血清型研究[J].中国预防兽医学报，2018，40（08）：680-686.

[2]王雪梅，郭红霞，郭莉娟，林琳，李建龙，代敏，孙丰慧.120株奶牛乳腺炎流行病原菌的分类和耐药谱分析[J].成都医学院学报，2017，12（05）：555-560.

[3]董翔宸，马友记，张勇，胡俊杰，赵兴绪.奶牛乳腺炎主要病原菌的药物敏感性检测[J].中国兽医学报，2015，35（09）：1505-1510.

[4]尹婷慧，王熙涛，徐永平，王丽丽，陈红莉，吴妍妍，李晓宇.奶牛乳腺炎病原菌的分离、耐药性分析及其特异性卵黄抗体的体外抑菌效果[J].饲料与畜牧，2015（08）：31-35.

[5]赵香汝，崔红玉，徐明举，李继连.奶牛乳腺炎病原菌的耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2007（09）：68.