黄赟 李智文 黄晅昱 刘晨

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种在中国人群中高发、难治的常见肿瘤，近几十年来，肝癌患者的总生存率未有提高[1]。目前，临床上用于晚期HCC的有效治疗方法和策略非常有限，包括手术切除和肝移植、放疗、全身化疗和基于分子诊断的靶向治疗等[2]。但大多数HCC患者在确诊时已接近肿瘤终末期，并且HCC容易复发和远处转移，预后较差。因此，研发新型抗HCC药物具有十分重要的临床意义。和厚朴酚（honokiol，HNK）作为传统中药厚朴的有效成分之一，具有广泛的抗肿瘤活性。已有相关报道证实，HNK可以有效抑制乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、胶质瘤和黑色素瘤等恶性肿瘤的转移进展[3-6]，但在肝细胞癌中，HNK是否有抑制肿瘤细胞迁移和转移的能力仍需要进一步验证阐明。本研究旨在探索HNK对于肝癌细胞迁移、转移能力的影响，试图寻找合理的分子机制对其进行解释。我们的研究结果表明HNK可以作为一种天然、安全、有效的肝癌治疗辅助药物。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

抗磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p-PI3K（Tyr458）、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT（Ser473）、波形蛋白（Vimentin）、上皮-钙依赖性粘附蛋白（E-cadherin）、神经-钙依赖性粘附蛋白（N-cadherin）抗体均购自美国CellSignaling Technology公司。抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自美国Proteintech公司。牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清（FBS）、DMEM培养基购自美国Gibico公司。草酸铵结晶紫染色液购自北京索莱宝公司。苏木精染液、伊红染液购自北京雷根生物技术公司。Transwell细胞培养小室购自美国康宁公司。

1.2 细胞培养

人肝癌Hep3B细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞常规培养在37℃、5%CO2的恒温培养箱中。当细胞生长至70%左右密度时先更换为无血清培养基，再给予药物处理。

1.3 实验动物及动物模型建立

4～5周龄的雌性裸鼠（BALB/C-nu/nu；18～20 g）由上海实验动物中心提供，均饲养在福建医科大学动物实验中心SPF级动物房，实验方案经福建医科大学动物实验伦理委员会批准。肺转移模型设计如下：每只裸鼠通过尾静脉注射浓度为2.0×106的Hep3B细胞。1周后，将小鼠随机分成试验组（n=5）和对照组（n=5），每日腹腔注射HNK（50 mg/kg）或空载溶剂，持续5周。在第6周造模结束时处死并完整取出肺组织。统计肺部转移瘤结节个数并进行后续苏木精和伊红（H&E）染色。

1.4 H&E染色

裸鼠完整肺组织用4%的多聚甲醛固定、脱水后浸蜡、包埋、切片。H&E染色染色前先烤片1小时，再用梯度乙醇和二甲苯脱蜡至水化。接着用苏木精染色5～7分钟，再用伊红染色3分钟。最后脱水、透明、封片。

1.5 细胞划痕实验

在HNK刺激后，将细胞接种到6孔培养板中。当细胞生长至紧密接壤时，用移液枪头在细胞上轻轻划过直线，然后用磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）小心洗去细胞碎片；之后加入2 mL维持培养基（含2%FBS的DMEM）继续培养。使用显微镜（200×）在不同刺激时间点（0 h，48 h）观察同一位置细胞迁移情况变化。

1.6 细胞迁移试验

使用Transwell试验测定以评估细胞迁移能力变化。将细胞（1×105个/孔）置于transwell装置的上室中，用不含FBS的DMEM培养基培养；下室用500 μL含10%FBS的DMEM填充。将上述装置在37℃下孵育18小时。孵育期结束后，将固定迁移至上室隔膜下表面的细胞连同完整底膜一起剪切下来，并用2.0%结晶紫染色。显微镜下选择5个不同位点拍照并统计迁移细胞数量。

1.7 Western blot法检测蛋白水平

4℃条件下在细胞中加入蛋白裂解液，30分钟后收集细胞裂解液，超声碎裂细胞，离心（12 000 g，4℃，15分钟）后测定蛋白浓度，剩余样品混合上样缓冲液并置于100℃中变性5分钟。配置10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，分离蛋白后转移PVDF膜上，用相应一抗进行孵育（GAPDH稀释浓度为1：2 000，其余抗体均为1：1 000），TBST洗涤后用相应二抗孵育，化学发光法进行显影并进行灰度测定及统计。所有实验重复三次。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，所有数据均采用（）表示。计量资料比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HNK对Hep3B细胞迁移能力的影响

首先用不同浓度的HNK（20 μmol/L，30 μmol/L）刺激Hep3B细胞24小时。细胞划痕实验结果显示：与对照组相比，HNK处理组中Hep3B细胞的迁移能力降低[0 μmol/L：（45.0±5.8）%；20 μmol/L：（76.7±4.4）%；30 μmol/L：（92.0±1.5）%；0 μmol/L：20 μmol/L，P=0.012；0 μmol/L：30 μmol/L，P=0.001；20 μmol/L：30 μmol/L，P=0.030]，并显示出浓度依赖性趋势（见图1A）。Transwell迁移实验结果亦显示：与对照组相比，HNK处理后的Hep3B细胞迁移数目减少[0 μmol/L：（142.6±10.1）%；20 μmol/L：（74.0±6.4）%；30 μmol/L：（25.0±3.8）%；0 μmol/L：20 μmol/L，P=0.005；0 μmol/L：30 μmol/l，P=0.001；20 μmol/L：30 μmol/L，P=0.003]，并显示出浓度依赖性趋势（见图1B）。以上结果表明HNK具有抑制体外HCC细胞迁移的能力。

图1 HNK在体外对细胞迁移能力的影响

2.2 HNK对Hep3B细胞在体内转移能力的影响

我们使用Hep3B细胞构建裸鼠肺转移模型以评估HNK对HCC细胞转移性生长的影响（见图2）。H&E染色结果及肺转移瘤的统计结果均显示：HNK治疗组中的裸鼠肺转移结节数目低于对照组[（13.0±3.97）：（2.20±1.01）个，P=0.021）]。上述结果证实，HNK具有抑制体内HCC细胞转移的能力。

图2 HNK在体内对细胞转移能力的影响

2.3 HNK对Hep3B细胞PI3K/AKT通路及EMT相关蛋白的影响

如图3所示，我们观察到HNK在Hep3B细胞中能降低PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平，证实了HNK可以抑制Hep3B细胞中的PI3K/AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路的变化进一步影响了上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关蛋白的表达，包括波形蛋白（Vimentin）、上皮-钙依赖性粘附蛋白（E-cadherin）和神经-钙依赖性粘附蛋白（N-cadherin）的改变。结果提示：随着PI3K/AKT通路信号的减弱，E-cadherin蛋白的表达上调，而间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白的表达受到抑制，说明HNK可以通过抑制PI3K/AKT通路逆转EMT。详见表1。

表1 p-PI3K、p-AKT、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白的相对表达量（，n=3）

表1 p-PI3K、p-AKT、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白的相对表达量（，n=3）

注：与0μm HNK治疗组比较，*P＜0.05；与20μmol/L HNK治疗组比较，#P＜0.05

images/BZ_138_213_1101_2303_1148.pngp-PI3K/PI3K 1.05±0.16 0.15±0.03* 0.07±0.02*#p-AKT/AKT 0.83±0.12 0.35±0.04* 0.20±0.05*#Vimentin/GAPDH 0.68±0.11 0.21±0.06* 0.11±0.03*#N-cadherin/GAPDH 0.93±0.13 0.62±0.07* 0.18±0.04*#E-cadherin/GAPDH 0.22±0.05 0.41±0.07* 0.89±0.14*#

图3 p-PI3K、p-AKT、Vimentin、N-cadherin和E-cadherin蛋白的Western blot结果

3 讨论

中草药是祖国传统医学的瑰宝，其具有副作用较小、应用广泛等有点。HNK作为传统中草药厚朴的有效成分之一，已被证实在多种肿瘤中具有广泛的抗癌作用[3，7-8]。本研究证实，HNK能够在体外有效抑制Hep3B细胞的迁移能力；在体内机制研究中，人肝癌细胞裸鼠肺部成瘤模型的实验结果显示HNK治疗抑制了Hep3B细胞转移至肺部成瘤的能力。上述实验结果共同验证了HNK对HCC细胞转移能力的抑制作用。

HCC作为一种高发、难治的常见病，其高死亡率和低治愈率在很大程度上是由于晚期肿瘤的远处转移。目前普遍认为上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤转移的分子机制其中起着重要作用，在肿瘤进展、转移和耐药性等领域已经有了广泛而深入的研究[9-10]。因此，我们推测HNK对Hep3B细胞迁移和转移的抑制作用有可能与抑制EMT有关。在本研究中，蛋白质印迹实验的结果证实了我们的假设：HNK治疗后，上皮标记物E-钙粘蛋白上调，而间质标记物波形蛋白（一种细胞骨架蛋白）和N-钙粘蛋白（一种细胞表面蛋白）则相应下调，证实了HNK能够通过抑制肝癌细胞的EMT来抑制肿瘤的迁移和转移能力。

PI3K/AKT通路是一个经典的关键致癌信号通路，其影响肿瘤发展的多个关键方面，包括细胞周期转变、增殖、细胞粘附、运动和侵袭性[11-12]。PI3K/AKT通路的异常激活在HCC中频繁被报道，以通路中关键蛋白的磷酸化水平升高为特征。既往相关研究表明，HNK能够通过降低相关蛋白磷酸化水平抑制PI3K/Akt途径[13-14]。本研究结果证明了HNK在HCC中下调了PI3K/AKT通路相关蛋白的表达，并最终抑制了EMT，这与之前报道的PI3K/Akt通路也参与了EMT的诱导相关文献结果一致[15-16]。因此，HNK作为一种天然的PI3K抑制剂，具有有效抗肝细胞癌的作用。

综上所述，我们得出结论：HNK通过抑制PI3K/AKT通路逆转EMT，进而抑制了HCC细胞的侵袭和转移能力。NHK作为一种天然高效的抗癌药物，在HCC治疗中具有广阔的研究前景和巨大的临床应用价值。