于林楠 张奎全 祁 啸 高 爽 任立新

(锦州医科大学附属第三医院综合一科, 锦州121000)

肺癌是人类发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤，其对人类的生命健康造成巨大威胁[1]。近30年来很多国家报道肺癌的发病率、死亡率均呈明显的上升趋势，其中男性肺癌发病率和死亡率居所有恶性肿瘤之首[2,3]。临床上首选治疗方案以外科手术为主，放疗、化疗为辅，但其预后不甚理想，存在很多并发症，如食管癌、脊髓炎等[4]。因此，寻找高效的精准靶向治疗意义重大。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类约18～25个核苷酸组成的内源性短链非编码RNA，其在肿瘤中作为癌基因或抑癌基因发挥作用[5]。敲减抑癌miRNA会上调其靶向的癌基因，而致癌miRNA的过度表达能下调其靶向的肿瘤抑制基因，这为肿瘤治疗开辟了新方向[6,7]。miR-144-3p在多种癌症中均为抑癌基因，包括肺癌、肺腺癌、肺鳞癌等[8-10]。但miR-144-3p在肺癌中的作用机制尚未完全研究清楚。人表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为酪氨酸激酶家族成员之一，其由跨膜区域、胞外受体结合区域、胞内酪氨酸激酶区域组成[11]。EGFR是晚期肺癌中最常见的癌症驱动因子。自噬(Autophagy)发生在动物细胞中，能够吞噬自身细胞器并使其与溶酶体结合形成自噬溶酶体，以降解内容物，完成细胞本身的代谢和细胞器的更新，其既可保护正常细胞的DNA受损、蛋白质堆积，又可使癌细胞免受或耐受抗癌治疗。尽管如此，自噬调节药物也已开始在临床上应用[12,13]。本研究将检测肺癌细胞中miR-144-3p、EGFR的表达，观察过表达miR-144-3p、敲减EGFR、过表达EGFR对肺癌细胞迁移、侵袭、自噬的影响，揭示miR-144-3p可抑制肺癌细胞迁移、侵袭，促进自噬，其机制可能与靶向EGFR有关，将为肺癌的靶向预防和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人肺腺癌细胞A549购自ATCC；BCA蛋白定量试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000、逆转录试剂盒购自大连TaKaRa公司；PVDF膜购自德国罗氏诊断有限公司；Transwell小室、基质胶、DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Sigma公司；流式细胞仪(FALS CALIBAR)购于美国BD公司；ABI 7500型实时荧光定量PCR系统购于美国ABI公司；pc DNA3.1购自上海酶研生物；RNA抽提试剂盒购自南京莱富赛生物公司；miR-144-3p mimics(UCAUGUAGUAGAU-AUGACAU)、 miR-control (UUCUCGAACGUGUCAC-GUUUU)、sicontrol(UUCUCCGAACGUGUCACGU)、 siEGFR(UGUCUGGAAACAGUCCUGCUCCUCA)均购自上海吉玛公司；鼠抗人EGFR多克隆抗体购自上海盟研公司；兔抗人LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1多克隆抗体购自碧云天；辣根过氧化物酶标记的IgG抗体购自深圳豪地华拓公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人肺腺癌细胞A549均用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃，5%CO2的培养箱中常规培养。

1.2.2细胞转染 收集对数生长期A549细胞，用LipofectamineTM2000脂质体将miR-144-3p组(转染miR-144-3p mimics)、miR-NC组(miR-control)、si-NC组(转染si-control)siEGFR组(转染siEGFR)、miR-144-3p+pcDNA 3.1组(miR-144-3p mimics和pcDNA 3.1共转染)、miR-144-3p+EGFR组(miR-144-3p mimics和pcDNA 3.1-EGFR共转染)，转染6 h后，更换培养基，继续培养48 h，用qRT-PCR法检测转染效果。转染成功后，进行qRT-PCR、Western blot、Transwell、双荧光素酶报告基因检测实验并分析结果。

1.2.3qRT-PCR实验 取适量1.2.2中对数生长期各组细胞，用Trizol液裂解细胞后，按照RNA抽提试剂盒说明书操作提取RNA，进行定量，然后用逆转录试剂盒按照说明书操作合成cDNA。再按照qRT-PCR试剂盒说明书操作进行EGFR和miR-144-3p的检测。用2-ΔΔCt计算EGFR和miR-144-3p的相对表达水平。

1.2.4Western blot实验 取适量对数生长期1.2.2中各组细胞，RIPA裂解后，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量后变性，然后进行SDS蛋白电泳，之后进行PVDF转膜，脱脂奶粉封闭2 h,然后用一抗，4℃孵育过夜。次日，洗膜后用标记过的二抗37℃孵育2 h。最后加入显影混合液，进行曝光。以目的条带灰度值与GADPH灰度值的比值表示目的蛋白EGFR相对表达情况。

1.2.5Transwell检测细胞迁移、侵袭 取适量对数生长期1.2.2中各组细胞，调整细胞密度至105个/ml。取100 μl加入上室，再取600 μl含血清的培养基加入下室，培养过夜。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，PBS洗涤3次，固定30 min，0.1%结晶紫染色约20 min，PBS洗涤3次。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞，随机取5个视野计数，取平均数。

细胞侵袭检测需在小室上表面涂抹适量厚度的基质胶，其余按照迁移检测实验步骤操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞，随机取5个视野计数，取平均数。

1.2.6双荧光素酶报告基因实验 取适量对数生长期1.2.2中各组细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册要求操作。psiCHECK2载体以萤火虫荧光素酶活性为内参，检测psiCHECK2-EGFR-3′UTR WT和psiCHECK2-EGFR-3′UTR MUT的表达，观察miR-144-3p与EGFR的结合能力。

2 结果

2.1miR-144-3p和EGFR在肺癌细胞中的表达 运用qRT-PCR检测BEAS-2B、A549细胞中miR-144-3p和EGFR mRNA的表达，与BEAS-2B细胞相比，A549细胞中miR-144-3p表达显著降低，EGFR表达显著升高(图1A)；用Western blot检测BEAS-2B、A549细胞中EGFR的蛋白表达，与BEAS-2B细胞相比，A549细胞中EGFR的蛋白表达量显著升高(图1B、C)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.2过表达miR-144-3p对A549细胞迁移、侵袭及自噬的影响 将miR-144-3p mimics、miR-NC转染至A549细胞，标记为miR-144-3p组、miR-NC组。与miR-NC组相比，miR-144-3p组细胞中miR-144-3p的表达显著升高(图2A)，细胞迁移和侵袭量均显著降低(图2B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表达量均显著升高(图2C、D)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.3敲减EGFR对A549细胞迁移、侵袭及自噬的影响 将si-EGFR、si-NC转染至A549细胞，标记为si-EGFR组、si-NC组。与si-NC组相比，si-EGFR组

图1 miR-144-3p和EGFR在肺癌细胞中的表达Fig.1 Expression of miR-144-3p and EGFR in lung cancer cellsNote: A.mRNA expression of miR-144-3p and EGFR in BEAS-2B and A549 cells;B and C.Protein expression of EGFR in BEAS-2B and A549 cells;*.P<0.05 vs BEAS-2B group.

图2 过表达miR-144-3p对A549细胞迁移、侵袭及自噬的影响Fig.2 Effect of overexpression of miR-144-3p on migration,invasion and autophagy of A549 cellsNote: A.miR-144-3p mimics on the expression of miR-144-3p in A549 cells;B.miR-144-3p on the effect of migration and invasion of A549 cells;C and D.miR-144-3p on the effect of the proteins expression of autophagy-related proteins in A549 cells;*.P<0.05 vs miR-NC group.

细胞中EGFR的表达显著升高(图3A)，细胞迁移和侵袭量均显著降低(图3B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表达量均显著升高(图3C、D)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.4miR-144-3p的靶基因EGFR 通过TargetScan对miR-144-3p和EGFR的结合进行预测，发现miR-144-3p与EGFR存在结合位点(图4A)。运用双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞荧光活性，与miR-NC组相比，miR-144-3p组WT-EGFR细胞的荧光活性显著降低，MUT-EGFR细胞的荧光活性差异不明显(图4)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。可见，EGFR是miR-144-3p的靶基因。

2.5过表达EGFR逆转了miR-144-3p对A549细胞迁移、侵袭及自噬的抑制作用 与miR-NC组相比，miR-144-3p组细胞中EGFR mRNA表达显著降低(图5A)，细胞迁移、侵袭量均显著降低(图5B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表达量均显著升高(图5C、D)；与miR-144-3p+pcDNA 3.1组相比，miR-144-3p+pcDNA 3.1-EGFR组细胞中EGFR mRNA表达显著升高(图5A)，细胞迁移、侵袭量均显著升高(图5B)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的蛋白表达量均显著降低(图5C、D),差异均具有统计学意义(P<0.05)。可见，过表达EGFR逆转了miR-144-3p对A549细胞迁移、侵袭及自噬的抑制作用。

图3 敲减EGFR对A549细胞迁移、侵袭及自噬的影响Fig.3 Effect of knockdown of EGFR on migration,invasion and autophagy of A549 cellsNote: A.EGFR on the expression of EGFR in A549 cells;B.EGFR on the migration and invasion of A549 cells;C and D.EGFR on the protein expression of autophagy-related proteins in A549 cells;*.P<0.05 vs si-NC group.

图4 EGFR与miR-144-3p的结合作用Fig.4 Binding function between EGFR and miR-144-3pNote: A.The 3′UTR of miR-144-3p contains a nucleotide sequence complementary to EGFR;B.The effect of miR-144-3p on the fluorescence activity of A549 cells;*.P<0.05 vs miR-NC group.

图5 过表达EGFR逆转miR-144-3p对A549细胞迁移侵袭及自噬的抑制作用Fig.5 Overexpression of EGFR reverses inhibitory effect of miR-144-3p on migration,invasion and autoph-agy of A549 cellsNote: A.The effect of different treatment groups on the mRNA expression of EGFR in A549 cells;B.The effect of different treatment groups on migration and invasion of A549 cells;C and D.The effect of different treatment groups on the protein expression of autophagy-related proteins in A549 cells.Compared with miR-NC group,*.P<0.05;compared with miR-144-3p+pcDNA3.1 group,#.P<0.05.

3 讨论

EGFR在机体的各种上皮肿瘤中过度表达、扩增或突变，并与肿瘤的侵袭性和治疗抗性密切相关。自噬激活参与肿瘤细胞的生存调控[14]。Jutten等[15]运用qPCR、免疫组织化学、克隆生存、增殖测量实验检测EGFR与自噬的关系发现，高EGFR表达细胞对自噬抑制剂氯喹更敏感，且高EGFR表达细胞表现出较低的自噬通量，揭示EGFR高表达细胞和肿瘤的存活高度依赖于自噬。Wei等[16]在非小细胞肺癌的研究中发现，EGFR可与自噬蛋白Beclin1结合，导致其多位点酪氨酸磷酸化，增强与抑制剂的结合力，并降低Beclin1相关的VPS34激酶活性，EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)可逆转EGFR突变，将Beclin1与其抑制剂结合以恢复非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)细胞的自噬，进一步在NSCLC肿瘤异种移植中发现，酪氨酸磷酸化Beclin1突变体的表达导致自噬减少、肿瘤生长增强、肿瘤去分化和对TKI治疗的抵抗。因此，致癌受体酪氨酸激酶可直接调节核心自噬机制，这可能有助于肿瘤进展和化学抗性。潘云虎[17]研究发现，EGFR在肺腺癌组织中高表达且于miR-646的表达呈负相关，其与miR-646在肺腺癌细胞中为靶向关系，过表达miR-646可抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭。马阳等[18]在肺腺癌的研究中阐明，EGFR在肺腺癌中高表达，且沉默EGFR可增强A549细胞的自噬能力，深入研究发现，非突变EGFR的自噬活性显著高于突变EGFR，揭示肺腺癌细胞的自噬活性除了与EGFR表达量相关外，还与EGFR突变状态有关。本研究运用qRT-PCR、Western blot检测了肺癌细胞中EGFR的表达发现，EGFR在肺癌中高表达，这与前人的研究结果相吻合；进一步用Transwell检测了沉默EGFR的A549细胞的迁移和侵袭，沉默EGFR可抑制肺癌细胞的迁移和侵袭，且可促进细胞自噬蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的表达，提示沉默EGFR可抑制肺癌迁移和侵袭，促进自噬。

miRNAs 为18～22 nt的非编码小RNA，通过与靶基因mRNA发生特异性结合而影响其转录和翻译，发挥基因调控功能[19]。miRNAs 可调控大约 50%以上的哺乳动物基因蛋白编码[20]。大量研究表明miRNAs 参与多种生物调控，其在恶性肿瘤进展中的作用尤为突出。微阵列数据Meta分析显示，miRNAs中的miR-144在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌中均为低表达[21]。李伟等[22]报道，miR-144在肺鳞癌中低表达，且miR-144的表达量与患者生存率呈正相关，进一步在DAVID网站预测其信号通路发现，miR-144可通过72个预测靶点参与Ras、Wnt、Hippo等信号通路调节细胞的生存，进而影响患者的存活时间。陈闪闪[23]在肺癌的研究中发现，miR-144在肺癌组织中低表达，且其与患者肿瘤的恶性程度呈负相关，过表达miR-144可抑制肺癌细胞增殖，促进细胞凋亡和自噬，并可抑制裸鼠的成瘤，其机制与miR-144靶向负调控TIGAR有关。本研究检测了miR-144-3p在肺癌细胞中的表达发现，miR-144-3p低表达，这与前人的研究结果相一致；进一步通过过表达miR-144-3p的肺癌细胞发现，过表达miR-144-3p可抑制肺癌细胞迁移侵袭，促进自噬；双荧光素酶报告基因检测实验验证，EGFR为miR-144-3p的靶基因，且过表达EGFR可逆转miR-144-3p对肺癌细胞迁移、侵袭及自噬的作用。

综上所述，miR-144-3p可抑制肺癌细胞迁移侵袭并促进自噬，其机制可能与靶向EGFR有关，为肺癌的靶向治疗提供新靶点。