刘海鹏

（衡水学院生命科学系 河北 衡水 053000）

金黄色葡萄球菌是常见的引起皮肤感染和食物中毒的致病菌[1]，易引起不同程度的化脓性炎症，扩散疾病，如肺炎、菌血症和败血症等。随着抗菌药物在医学和兽医临床上的广泛应用，金黄色葡萄球菌的耐药性越来越高，已经进化出了抵抗免疫系统攻击的种类[2]。沙蚕是一类生活在海边潮间带的海洋生物，体内含有多种生物活性成分，是可利用的重要的药物资源[3]，因此研究和开发沙蚕体内抗菌活性成分对解决耐药菌株有重要意义。采用乙酸乙酯对沙蚕体内活性物质进行提取，并对提取物进行金黄色葡萄球菌体外抑菌实验，为沙蚕体内生物活性物质的开发提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品与菌株。沙蚕，采购于山东舟山某水产养殖场。金黄色葡萄球菌，衡水学院微生物实验室提供。

1.1.2 主要仪器。电热鼓风干燥箱、XDSY-2000A旋转蒸发仪、SW-CT-IF超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、超声波震荡仪。

1.2 试验方法

1.2.1 沙蚕提取物的制备。将清水洗净的沙蚕烘干、粉碎后研磨成粉末状，将乙酸乙酯和沙蚕混匀，超声波震荡仪中震荡30min，重复3次，所得滤液置于旋转蒸发仪中浓缩，最后所得溶液用乙酸乙酯稀释至浓度为100mg/ml，高压灭菌后，放于4℃冰箱保存，备用。

1.2.2 菌悬液的制备。无菌条件下，将活化的金黄色葡萄球菌接种至LB培养基进行恒温培养，并计算菌悬液浓度。取1 ml已制备好的菌悬液加到9 ml无菌水中进行10倍倍比稀释，取1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9等5种稀释度涂板，每个浓度做3个平行，做好标记，将涂好后的培养基倒置于37℃恒温箱中培养1～2 d。选择每个平板上长有50～300个菌落的稀释度计算菌落形成单位数。计算公式：每1 ml样品中菌落形成单位数(CFU)=同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数，最后配制成浓度为1×106cfu/ml的菌液备用。

1.2.3 沙蚕提取物最小抑菌浓度(MIC)的测定。采用试管二倍稀释法测定每种沙蚕活性提取物的最低抑菌浓度(MIC)。取已处理好的无菌试管，通过试管二倍稀释法，制备试管提取物，浓度分别为50 mg/ml、12.5 mg/ml、 3.13 mg/ml、 0.78 mg/ml、 0.195 mg/ml、0.098 mg/ml，同时做空白对照和溶剂对照，空白对照不含提取物药液，溶剂对照不含提取物但含有等剂量相应溶剂。

1.2.4 体外抑菌圈直径测定。利用牛津杯法[4]测定沙蚕提取物体外抑菌圈直径。用移液枪吸取100 μl沙蚕提取物注入牛津杯内，将平板培养基在37℃恒温培养箱中培养24 h后观察并测量抑制圈的直径大小。每种提取物做3个重复，取平均值。结果判定，抑菌圈直径小于10 mm为轻度抑菌，抑菌圈直径10～15 mm为中度抑菌，抑菌圈直径15～20 mm为高度抑菌，抑菌直径大于20 mm为极度抑菌。

2 结果与分析

2.1 体外抑菌圈的测定。由表1可知，乙酸乙酯沙蚕提取物对金黄色葡萄球菌有中度抑菌效果。其抑菌圈直径平均值为11.49 mm，空白对照组和乙酸乙酯抑菌圈直径均为0 mm，无抑菌效果。

表1 不同沙蚕提取物体外抑菌圈直径及抑菌效果

2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定。由表2可知，乙酸乙酯沙蚕提取物金黄色葡萄球菌的MIC值为0.195 mg/ml。

表2 乙酸乙酯沙蚕提取物对金黄色葡萄球菌MIC的测定

3 讨论

由于抗生素的大量使用，使得临床上金黄色葡萄球菌的抗药性越来越强，因此发现新的抗菌药物迫在眉睫。本试验通过使用乙酸乙酯对沙蚕体内活性物质提取，发现其提取物对金黄色葡萄球菌具备一定的抗菌性，表明沙蚕体内的活性生物物质有一定抗菌性，为今后相关研究打下了一定基础。

在本试验中，通过体外抑菌效果的测定，表明在沙蚕体内存在某些生物活性物质，这些物质具有天然抗菌的作用，但抗菌效果并不显著，需要进一步对乙酸乙酯粗提物进行分化，看看是哪些具体的成分起到了抗菌作用。