郭社民 赵永旗 韩石蕊 张 峰

地黄滋肾合剂(豫药制字Z20120908)为结合中医临床应用研制的复方中药制剂，主要由生地黄、牡丹皮、茯苓皮、石韦、益母草、黄芪、丹参、醋龟甲、酒萸肉、盐泽泻、盐知母等组成，具有滋补肝肾、清热凉血、利水消肿、益气活血的功效，主治肝肾阴虚、气虚水湿失运所致形体消痩、头昏目眩、阴虚发热、虚烦不寐、口干舌红、少苔、面浮身肿、小便不利或赤少，用于以尿蛋白长期不退、高血压、水肿等为主要临床特征的肾病综合症及慢性肾炎浮肿。处方中主药酒萸肉所含有效成分为莫诺苷、马钱苷。莫诺苷具有健胃、预防糖尿病性血管病的作用，马钱苷具有调节免疫、抗炎及抗休克作用[1]；主药牡丹皮所含有效成分丹皮酚具有保肝护肾、抗炎、抗肿瘤、镇静、降温、解热、镇痛、解痉、降血糖、增强免疫力等多种药理作用[2～4]。原质量标准中无含量测定项，为更好地控制制剂质量，保证临床疗效。参考有关文献[5～11]建立了高效液相色谱法同时测定地黄滋肾合剂中莫诺苷、马钱苷和丹皮酚含量的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；XS205DU型电子分析天平(瑞士mettler公司)；UVIKONxl 型紫外分光光度计(法国塞克曼公司)。

1.2 材料莫诺苷对照品(批号：111998-201602，含量：96.3%)、马钱苷对照品(批号：111640-201707，含量：99.2%)、丹皮酚对照品(批号：110708-201801，含量：99.9%)均购于中国食品药品检定研究院；地黄滋肾合剂(批号分别为：180923、181017、181125)及阴性样品均由濮阳市人民医院制剂室提供；甲醇、乙腈为色谱纯，其他均为分析纯，水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm )；以乙腈为流动相A, 以0.3%磷酸溶液为流动相B, 梯度洗脱：0～5 min，5%～8% A；5～20 min，8% A；20～35 min，8%～20% A；35～45 min，20%～60% A；45～55 min，60% A；流速为1.0 ml/min；柱温40℃；检测波长为240 nm(莫诺苷、马钱苷)、274 nm(丹皮酚)；进样量 10 μl。

2.2 对照品溶液的制备分别精密称取莫诺苷对照品、马钱苷对照品和丹皮酚对照品适量，加50%甲醇制成每1 ml中含莫诺苷0.2556 mg、马钱苷0.2592 mg和丹皮酚0.6214 mg的溶液，作为混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液2 ml置25 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备精密量取样品5 ml置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，静置，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取阴性样品按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.4 专属性及系统适用性试验分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果表明本方法测定莫诺苷、马钱苷和丹皮酚具有良好的专属性，阴性对照无干扰。在此色谱条件下，各待测成分峰形良好，理论板数按莫诺苷、马钱苷计算均不低于4000。结果见图1。

2.5 线性关系考察分别精密量取混合对照品储备液 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分别置25ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度,摇匀，作为系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件，分别取10 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品溶液浓度(X，μg/ml)为横坐标, 以色谱峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归。结果莫诺苷、马钱苷和丹皮酚回归方程分别为:Y=17.8669X-0.1722，r=0.9999；Y=15.8567X+0.0661， r=0.9999；Y=11.2182X+0.1595，r=0.9999。表明莫诺苷在5.112～51.120 μg/ml、马钱苷在5.184～51.840 μg/ml、丹皮酚在12.428～124.285 μg/ml范围内浓度和峰面积线性关系良好。

1. 莫诺苷 2.马钱苷 3.丹皮酚图1 高效液相色谱图

2.6 精密度试验精密吸取混合对照品溶液10μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，分别计算峰面积的RSD。结果莫诺苷、马钱苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为0.86%、0.73%、0.85%(n=6)，表明精密度良好。

2.7 重复性试验精密称取同一批号的样品(批号：180923),按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件测定。分别计算含量和RSD，结果平均含量为每1ml含莫诺苷0.1667 mg、马钱苷0.1917 mg和丹皮酚0.4516 mg，RSD分别为0.99%、1.11%、0.95%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验取同一供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、10 、12 h时，精密吸取10μl，进样测定。结果莫诺苷、马钱苷和丹皮酚峰面积的RSD分别为1.13%、1.05%、1.07%(n=7)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.9 耐用性试验取同一份供试品溶液，其他色谱条件不变，改变色谱柱品牌： Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm )、Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、 Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm )，按拟订的色谱条件进样测定，记录峰面积，结果莫诺苷、马钱苷、丹皮酚峰面积的RSD均小于2%，且分离度均大于1.5，表明方法耐用性好。

2.10 加样回收率试验取已知含量的同一批样品(批号：180923) ，精密量取2.5ml，置50 ml量甁中，共6份,分别精密加入混合对照品储备液1.7 ml, 按“2.3”项下方法制备供试品溶液,依法测定,结果见表1。

表1 加样回收率试验结果 (n=6)

注： A为莫诺苷，B为马钱苷， C为丹皮酚

2.11 样品含量测定取样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别取供试品溶液和混合对照品溶液, 按“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果 (n=3)

3 讨论

三种待测成分溶解性不同[12，13]，丹皮酚在水中溶解性较差而易溶于甲醇，莫诺苷、马钱苷是酒萸肉中的水溶性成分。在选择溶剂时，分别以乙醇、甲醇、50%甲醇为溶剂，制备混合对照品溶液和供试品溶液，试验结果表明，以50%甲醇为溶剂效果较好，故以50%甲醇为溶剂制备供试品溶液。

取莫诺苷、马钱苷、丹皮酚对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果莫诺苷、马钱苷、丹皮酚的最大吸收波长分别为240、238、274 nm，经过试验比较，确定莫诺苷和马钱苷的检测波长为240 nm、丹皮酚的检测波长为274 nm。

由于供试品成分复杂，莫诺苷、马钱苷、丹皮酚三者的化学结构性质差别较大，在流动相选择试验时，曾试用甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液等不同组分和比例的流动相进行梯度洗脱，最终以流动相组分为乙腈(A)-3%磷酸溶液(B)，梯度洗脱，莫诺苷、马钱苷、丹皮酚三者峰型较好且均能与相邻色谱峰达到基线分离。

经方法学考察表明，通过变换检测波长，采用高效液相色谱法能够同时准确测定两主药中的3种有效成分，因此，在本制剂质量标准中增加莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量测定方法，能够更好控制产品质量，以便临床合理有效用药。