余亚英

黄精是一种中草药[1]，是百合科黄精属植物，种类繁多，常见以根茎入药，能提高人体的免疫功能[2]，能补气、润肺、健脾，还可以抗衰老、抗动脉粥样硬化、降血糖、降血脂、抗肿瘤等[3]，研究黄精所含黄精多糖的结构，对细胞免疫调节作用具有重要的意义[4]，本文以研究黄精多糖的分离、鉴定及免疫调节功效为主题，现报道如下。

1 黄精多糖的分离与鉴定

1.1 材料与试剂实验材料黄精，购买于河南的药材市场；使用莱阳经济技术开发区精细化工厂研制的硫酸，北京索莱宝科技公司生产的DPPH、DEAE-Sepharose Fast Flow、ABTS，美国Sigma公司生产的甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、PMP。

1.2 仪器上海天宇新企业发展有限公司生产的多功能粉碎机、日本岛津的GC-17AATF气相色谱仪，Alpha 1-2LDplus牌的冷冻干燥机，北京浦西通用仪器公司生产的紫外可见分光光度计(TU-1900)。

1.3 实验方法

1.3.1 黄精多糖的提取取适量的干燥黄精为实验材料，将黄精研磨粉碎，并过30目筛，然后再碾碎以后的黄精中加入相当于黄精10倍剂量的95%的乙醇溶液，进行回流提取1 h，收集滤渣，进行干燥处理。然后在收集起来的黄精滤渣中加入黄精滤渣的8倍剂量的水，将黄精滤渣与水混合搅匀，再回流提取1 h，再次进行抽滤，收集滤液，然后将收集起来的滤液置于60℃的条件下，进行压缩操作，将滤液压缩到一定的体积，然后再将无水乙醇缓慢滴入到滤液中，不断搅拌，等到乙醇的浓度到达80%以后，将其放入冰箱，冰箱温度控制在4℃，在冰箱中静置、沉淀12 h，第2日再进行抽滤操作，最后得到的滤饼就是黄精粗多糖。

1.3.2 黄精多糖的纯化对黄精多糖进行纯化操作。第一：脱蛋白。在黄精中加入适量的水，溶解黄精，按照体积比1∶3的比例混合溶解后的黄精与Sevage试剂，使其充分混合，静置，分层。收集上层的水相溶液，去掉下层的变性的蛋白质，将收集到的溶液减压浓缩，并冻干。第二：脱色。在黄精中加入适量的水，溶解黄精，在溶解后的黄精里加入适量的活性炭进行搅拌1 h，抽滤除掉活性炭，然后同样将收集到的溶液减压浓缩，并冻干。

1.3.3 黄精多糖鉴定利用斐林试剂鉴别法、Molisch反应沉淀方法、双缩脲反应方法、茚三酮反应方法、离子交换色谱分离黄精多糖的方法、柱前衍生化HPLC方法、Size-exclusion chromatography测分子量法、红外光谱法、MMR分析法对黄精多糖进行鉴定。利用DPPH方法、ABTS方法、鉴定黄精多糖的体外抗氧化能力。

1.4 结果与分析

1.4.1 鉴定结果经鉴定，黄精多糖的斐林试剂反应呈阴性，证明其不含游离的还原性单糖，Molisch反应呈阳性，证明其含有糖类物质，此外，在蛋白质的鉴定中，黄精多糖呈阴性，证明其不含蛋白质。见表1、表2。

表1 多糖鉴别

表2 蛋白质鉴定

1.4.2 黄精多糖的单糖组成经过鉴定分析，D-半乳糖、D-鼠李糖是四种多糖的主要组成部分，4种多糖中D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖的含量相对较少。见表3。

表3 单糖组成

1.4.3 黄精多糖的分离纯化经过DEAE-Sepharose Fast Flow的分离，黄精多糖得到PSP1、PSP2、PSP3、PSP4 4个部分。PSP是由纯水洗脱得到的，是中性多糖。PSP2、PSP3、PSP4是经过氯化钠溶液洗脱、然后脱盐、浓缩冻干后而得到的白色或者浅黄色固体，融水。

2 黄精多糖对RAW264.7细胞免疫调节作用

2.1 材料与仪器材料采用黄精多糖提取物；购买自中国科学院上海生命科学园细胞库的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系。仪器采用Tecan公司的酶标仪、美国Bio-Rad公司的CFX96 PCR仪，电泳仪。上海安亭仪器公司生产的低速台式离心机、日本Hyrayama公司提供的高压蒸汽灭菌锅、美国Eppenddorf公司生产的可调式微量加样器、美国Alphalnnotech公司提供的Alphalnnotech HP system凝胶成像仪等。实验试剂采用美国Sigma公司生产的MTT、SRB；澳洲Biological Industries 生产的胎牛血清；东洋纺上海生物科技有限公司的逆转录试剂；碧云天生物技术公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒评；上海西塘生物科技有限公司的TNE-a、IL-6 ELISA kit；北京Solarbio公司的RIPA细胞快速裂解液等。

2.2 实验方法对细胞进行复苏、培养、传代操作，然后利用MTT法和SRB法检测细胞的存活率，再观察黄精多糖对LDH活性的影响、黄精多糖对细胞形态的影响，并用中性红法测定RAW264.7细胞的吞噬能力等。

2.3 结果与讨论

2.3.1 对细胞存活率的影响本研究利用MTT法、SRB法对黄精多糖进行不同浓度对24 h RAW264.7细胞生长的影响的检测以后，发现黄精多糖的浓度与细胞的存活率有关系。当黄精多糖的浓度在0～400 μg/ml时，黄精多糖对RAW264.7细胞活性没有明显的影响；当黄精多糖的浓度在800 μg/ml以上时，RAW264.7的细胞活性明显受到影响，由此可知，在日后的实验中，为了避免细胞毒性对实验的干扰，应该将黄精多糖浓度控制在低于400 μg/ml的标准内。

2.3.2 对细胞受损的影响经过研究得出，黄精多糖的浓度对细胞的受损程度有一定的影响，当黄精多糖浓度在0～400 μg/ml时 RAW264.7细胞膜完好，无毒性。当黄精多糖的浓度在800 μg/ml以上时，RAW264.7细胞膜遭到破坏，细胞毒性增加[5～8]。

2.3.3 黄精多糖对细胞吞噬能力的影响研究得知，黄精多糖对细胞的巨噬能力能明显的增强作用，能激活巨噬细胞[9]，当黄精多糖浓度在200～400 μg/ml时，细胞的吞噬能力能明显提高，并且有一定的剂量依赖性，当黄精多糖的浓度在400 μg/ml以上时，RAW264.7细胞吞噬能力与阳性对照LPS组相近[10]。

3 总结

通过对黄精多糖进行提取、纯化、鉴定操作，发现黄精多糖是一种含有糖类物质、不含游离的还原性单糖、不含蛋白质的物质[11，12]。甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖都是黄精多糖的主要单糖组成成分，经过分离纯化，可得P1、PSP2、PSP3、PSP4这4种糖，此外黄精多糖的浓度对细胞的存活率、细胞的受损程度、细胞吞噬能力都有作用。