傅求真，韩冰，李燕妮，程波，王磊

火箭军特色医学中心1干部病房，2心胸外科，3健康管理科，4病理科，5神经内科，北京 100088

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种获得性免疫疾病，主要表现为部分或全身骨骼肌无力且极易疲劳，活动后症状加重，休息后减轻[1]。一项全球流行病学调查显示，MG的总发病率为（77～150）/100万，年发病率为（4～11）/100万，各年龄段均有发病，且女性发病率大于男性[2]。MG患者中，有65%～80%的患者合并胸腺增生，有10%～20%的患者伴发胸腺瘤[3]。相关研究表明，胸腺瘤可能与MG的发生发展有关，而乙酰胆碱受体抗体（acetylcholine receptor antibody，AchR-Ab）和连接素抗体（Titin-Ab）可能参与了神经疾病的发生发展[4]；AchR-Ab和Titin-Ab在老年胸腺瘤重症肌无力（thymoma myasthenia gravis，TMG）患者血清中呈高表达[5]，但关于AchR-Ab、Titin-Ab是否能应用于鉴别诊断TMG和非胸腺瘤 MG（nonthymomatous myasthenia gravis，NTMG）的研究仍较少。因此，本研究对老年TMG患者胸腺瘤组织和血清中AchR-Ab、Titin-Ab的表达情况进行分析，并对血清AchR-Ab、Titin-Ab在老年TMG中的诊断价值进行分析，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2009年2月1日至2018年12月20日火箭军特色医学中心收治的70例老年TMG患者为TMG组，82例老年NTMG患者为NTMG组。纳入标准：①经《诊断学（第5版）》[6]中相关诊断标准确诊，如疲劳试验阳性、新斯的明试验阳性、肌电图检查异常等；②合并胸腺瘤、胸腺增生，经术后病理检查确诊；③年龄≥60岁。排除标准：①精神异常者；②合并其他系统重大疾病者；③创伤所致神经肌肉损伤者；④不依从者。另外，以性别和年龄为匹配因素，选取同期于火箭军特色医学中心进行健康体检的75例老年健康体检者为健康对照组。TMG组中，男25例，女45例；年龄60～73岁，平均（66.2±4.5）岁。NTMG组中，男32例，女50例；年龄 61～75岁，平均（67.0±5.1）岁；胸腺增生MG 50例，胸腺未病变MG 32例。健康对照组中，男28例，女47例；年龄60～72岁，平均（65.9±4.8）岁。3组受试者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会审查通过，所有研究对象均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 酶联免疫吸附试验检测血清AchR-Ab和Titin-Ab 表达水平 采集所有受试者的清晨空腹静脉血2 ml，随后10 000 r/min离心10 min，取上清于-80℃冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒检测血清AchR-Ab和Titin-Ab的表达水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书的规范进行操作；显色终止后10 min内立即采用美国AWARENESS酶标仪在450 nm和630 nm波长下检测吸光度（absorbance，OD）值，实际OD值=样品孔OD值-空白孔OD值。

1.2.2 免疫组化法检测不同组织中AchR-Ab和Titin-Ab 阳性表达情况 所有TMG患者和NTMG患者均行胸腺切除手术并进行术后病理检查，分别取TMG患者的胸腺瘤组织和胸腺瘤旁组织，取NTMG患者的胸腺增生组织和正常胸腺组织，迅速于-80℃冰箱中保存待检。采用免疫组化法检测不同组织中AchR-Ab和Titin-Ab的阳性表达情况。

1.3 观察指标及判定标准

比较3组受试者血清AchR-Ab、Titin-Ab的表达情况，及TMG患者和NTMG患者不同组织中AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达情况，并对AchRAb、Titin-Ab在TMG患者胸腺瘤组织和血清中阳性表达的相关性进行分析。以病理结果为金标准，对血清AchR-Ab、Titin-Ab鉴别诊断TMG的效能进行分析。

血清AchR-Ab、Titin-Ab阳性判定标准：以AchR-Ab的OD值≥0.25为AchR-Ab阳性表达，以Titin-Ab的OD值≥0.19为Titin-Ab阳性表达[7]。免疫组化法染色结果阳性判定标准：采用Mattern积分法[8]进行判读，每例标本随机选取10个高倍视野（×400），分别计数100个肿瘤细胞，取其平均值计算阳性细胞所占比例；无阳性细胞为0分，阳性细胞所占比例＜25%为1分，25%≤阳性细胞所占比例≤50%为2分，阳性细胞所占比例＞50%为3分。染色强度评分根据染色特征判定，不着色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分。将阳性细胞所占比例评分与染色强度评分相加后，＞3分为阳性，≤3分为阴性。

本研究采用串联诊断试验确定血清AchR-Ab和Titin-Ab对TMG的诊断效能。串联诊断试验的判断标准：两种诊断指标均为阳性则判为阳性，有一个指标为阴性则判为阴性。灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%，诊断准确率=（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清AchR-Ab、Titin-Ab 表达情况的比较

TMG组、NTMG组和健康对照组受试者的血清AchR-Ab、Titin-Ab表达水平比较，差异均有统计学意义（F=43.476、123.152，P＜0.01）；且3组受试者的血清AchR-Ab、Titin-Ab阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=68.555、72.325，P＜0.01）。TMG组受试者血清AchR-Ab、Titin-Ab的表达水平和阳性表达率均高于NTMG组和健康对照组，NTMG组受试者血清AchR-Ab、Titin-Ab的表达水平和阳性表达率均高于健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同组别受试者血清AchR-Ab、Titin-Ab表达情况的比较

2.2 不同组织中AchR-Ab、Titin-Ab 阳性表达情况的比较

胸腺瘤组织、胸腺瘤旁组织、胸腺增生组织和正常胸腺组织中AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（χ2=71.358、63.083，P＜0.01）；其中AchR-Ab和Titin-Ab的阳性表达率在胸腺瘤组织中最高，在胸腺增生组织和胸腺瘤旁组织中次之，在正常胸腺组织中最低。（表2）

表2 不同组织中AchR-Ab、Titin-Ab阳性表达情况的比较[n（%）]

2.3 TMG 患者胸腺瘤组织和血清中AchR-Ab、Titin-Ab 阳性表达的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，TMG患者血清AchR-Ab的阳性表达与胸腺瘤组织中AchR-Ab的阳性表达呈正相关（r=0.632，P＜0.01）；TMG患者血清Titin-Ab的阳性表达与胸腺瘤组织中Titin-Ab的阳性表达呈正相关（r=0.651，P=0.014）。

2.4 血清AchR-Ab和Titin-Ab 单独及联合检测诊断TMG 的效能分析

血清AchR-Ab、Titin-Ab、AchR-Ab+Titin-Ab检测诊断TMG的准确度、灵敏度、特异度和Kappa值分别为 68.4%、88.6%、51.2%和 0.385；71.1%、82.9%、61.0%和 0.429；80.3%、80.0%、80.5%和0.604。血清AchR-Ab、Titin-Ab联合检测诊断TMG的效能高于两者单独检测。（表3）

表3 AchR-Ab、Titin-Ab单独和联合检测对TMG的诊断结果与术后病理结果的对照

3 讨论

乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AchR）被抑制或异常表达是MG发生的主要危险因素之一[9]。AchR-Ab由机体自身产生并能够在补体的参与下与AchR相互结合，破坏AchR的功能，进而影响神经肌肉信号转导，导致肌无力[10]。另外，Titin-Ab还能够参与肌节之间的组成和肌丝系统的连接，维持肌肉张力，调节肌节的弹性，因而其也是MG发生的重要因素[11]。研究表明，20%～30%的MG患者多伴发胸腺瘤，而小的胸腺瘤不易被发现，且能够间接合并多种其他疾病，如单纯红细胞再生障碍性贫血、低球蛋白血症、肾炎肾病综合征、系统性红斑狼疮等[12]。

相关研究表明，AchR-Ab和Titin-Ab可能与胸腺瘤的发生、发展密切相关[13]。本研究结果显示，TMG患者血清AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达率均高于80%，且TMG组受试者血清AchR-Ab、Titin-Ab的表达水平和阳性表达率均高于NTMG组和健康对照组（P＜0.05）。提示虽然多数MG患者的血清中可检测到AchR-Ab和Titin-Ab表达，但其在TMG患者中仍具有一定的特异性。Cordts等[14]研究发现，TMG患者血清中AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达率均高于NTMG患者，与本研究结果相似。本研究结果还显示，胸腺瘤组织、胸腺瘤旁组织、胸腺增生组织和正常胸腺组织中AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），而AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达率在胸腺瘤组织中最高，提示胸腺瘤的发生发展与AchRAb、Titin-Ab的阳性表达密切相关，这可能是由于在原癌基因和抑癌基因突变导致的失衡过程中，使得AchR-Ab和Titin-Ab基因被异常激活所致。胸腺增生组织和胸腺瘤旁组织中AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达率也较高，增生组织多被认为是肿瘤发生的先兆，这可能是增生组织中AchR-Ab和Titin-Ab出现阳性表达的原因。因血液取样较组织取样更容易，因而成为临床诊断和检查的主要标本，但血液中的指标并不能完全直观地反映实际病灶的情况，因此，本研究观察了TMG患者血液和胸腺瘤组织中AchR-Ab和Titin-Ab阳性表达的相关性，结果显示，TMG患者血清AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达分别与胸腺瘤组织中AchR-Ab、Titin-Ab的阳性表达呈正相关（P＜0.01），提示血清AchR-Ab和Titin-Ab的表达可以作为诊断胸腺瘤的辅助诊断依据。为了进一步确定血清AchR-Ab和Titin-Ab对TMG患者的诊断效能，本研究对TMG患者和NTMG患者进行诊断试验，结果显示血清AchR-Ab和Titin-Ab联合检测诊断TMG的特异度明显高于两种指标单独检测，且Kappa值＞0.6，表明AchR-Ab和Titin-Ab联合检测的诊断价值较高，可以减少胸腺增生对胸腺肿瘤诊断结局的影响，在临床实践中可酌情应用，为TMG患者的术前诊断和手术方案的确定提供线索。

综上所述，TMG患者血清中AchR-Ab、Titin-Ab的表达上调，且两者在血清与胸腺瘤组织中的阳性表达呈正相关，两者联合检测有助于鉴别TMG与NTMG。