任梦梦，傅宏鑫，马毅，王菊芳

（华南理工大学，广东广州 510006）

随着经济全球化进程的加快，能源供需矛盾、生态环境恶化等问题日益突出[1]。一次性能源消耗持续增加，使用过程严重污染环境，产生氮氧化物、硫氧化物、一氧化碳、二氧化碳、甲烷以及有毒的粉尘等[2]。因此，节能减排面临巨大挑战，寻找绿色可再生的替代能源迫在眉睫。

生物质能源具有资源丰富、分布广泛、可再生、清洁、安全等优点。地球上每年通过光合作用合成的生物质约有1 800亿吨，蕴含其中的能量是世界能源消耗总量的10～15倍，但利用率低于3%，生物能源的开发利用，市场前景广阔。生物燃料乙醇具有较高的辛烷值，享有“液体黄金”的美誉，广泛应用于化工、医疗、国防和食品等领域。由于世界粮食紧缺，以粮食为原料生产第一代乙醇必将导致“与人争粮、与粮争地”的现象发生[3]，严重阻碍燃料乙醇的工业化发展。因此，利用“非粮”生物质合成乙醇是最切实可行的生物燃料生产方式。

许多嗜热厌氧菌能直接降解纤维素和半纤维素，这使得它们成为研究乙醇生产的热点[4]。同时它们还具有如下一些优势：第一，具有广泛的底物谱，能够利用纤维素水解液中的五碳糖和六碳糖（主要是葡萄糖和木糖）；第二，对环境的耐受性较强，在较宽的pH和温度范围内都能保持良好活性；第三，较高的操作温度易于产物的分离纯化且不易被污染。本课题组前期筛选得到一株嗜热厌氧杆菌，鉴定为Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27[5]。通过阻断嗜热厌氧杆菌的乳酸合成途径，获得突变株T.aotearoense SCUT27Δldh的乙醇得率提高2倍[6]，而且其能够高效利用木薯浆水解液为底物发酵生产乙醇[7]。但是，游离细胞发酵时存在生长能力较弱、糖耗速率慢与乙醇产量低等问题。

氮源是微生物生长过程中必需的营养物质，参与细胞内许多代谢过程，可促进菌株生长，调节胞内初级代谢产物与次级代谢产物的比例，控制菌体的生长速率，影响产物的生成与底物的消耗[8]。目前，乙醇发酵中常用的有机氮源为酵母提取物、胰蛋白胨、玉米浆、氨基酸等[9]。实验室中利用最广泛的氮源是酵母提取物，因其能赋予菌株突出的发酵性能而广为使用，胰蛋白胨作为一种速效氮源，也能显著促进菌株的生长。因此，本文分别以葡萄糖、木糖及混合糖为底物，探究酵母提取物和胰蛋白胨添加对嗜热厌氧杆菌生产乙醇的影响，为其工业化应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用的菌株T.aotearoense SCUT27Δldh是通过同源重组双交换方式敲除T.aotearoense SCUT27中乳酸脱氢酶基因（ldh）获得，具有优良的乙醇发酵性能[6]。

1.1.2 培养基配方

液体培养基采用嗜热厌氧杆菌MTC培养基[10]。培养基成分均为分析纯，其中酵母提取物和胰蛋白胨购自英国Oxoid公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜热厌氧杆菌添加不同氮源的摇瓶发酵试验

在摇瓶发酵MTC培养基中，分别以葡萄糖、木糖以及混合糖（葡萄糖、木糖的比例为2∶1）为底物，培养中分别添加1 g/L的酵母提取物、4 g/L的酵母提取物与2 g/L的胰蛋白胨、10 g/L的酵母提取物与5 g/L的胰蛋白胨，其余成分不变（以MTC培养基为对照）。将活化扩大培养后的菌株种子液于超净工作台内按10%的接种量（V/V）接种到120 mL的血清瓶中，在55 ℃、150 r/min条件下摇瓶发酵，在发酵过程中每隔4 h取样用于检测菌株的生物量以及产物、底物的含量。

1.2.2 细胞密度的测定

测定细胞的生物量时，使用紫外可见分光光度计记录其在波长600 nm处的吸光值。

1.2.3 产物和底物浓度的测定

将发酵样品在高速离心机中以12 000 r/min的转速离心10 min后，取380 μL上清液和1 520 μL去离子水，并与100 μL浓度为10%（V/V）稀硫酸混匀，过滤除菌用高效液相色谱仪检测并计算其含量。

使用高效液相色谱分析仪（HPLC，Waters 2695）检测发酵液中各组分的含量，详细参数如下：有机酸色谱柱为Aminex HPX-87P分离柱；检测器为Milford RI-2414示差检测器；流动相为2.5 mmol/L H2SO4；流速为0.6 mL/min；柱温箱温度为60 ℃；检测室温度为40 ℃；进样量为10 μL。

2 结果与分析

2.1 有机氮源添加对T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖发酵的影响

为了进一步提高菌株的乙醇发酵性能，本研究对培养基有机氮源进行了优化。首先，以葡萄糖为底物，参照文献[11]在MTC培养基中分别添加1 g/L酵母提取物、4 g/L酵母提取物与2 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物与5 g/L胰蛋白胨。实验结果如图1和表1所示，在MTC培养基中添加1 g/L酵母提取物时，T.aotearoense SCUT27Δldh的生物量、葡萄糖消耗量和乙醇浓度比对照分别提高24%、28%和34%，表明酵母提取物中的氮源、氨基酸和生长因子等有效成分可以促进菌株的生长和底物的消耗（表1）。然而，低浓度酵母提取物添加对乙醇生产强度的提升不显著。继续增加酵母提取物浓度至4 g/L并补充适量的胰蛋白胨（2 g/L），T.aotearoense SCUT27Δldh的生物量、葡萄糖消耗量、乙醇浓度增加至5.47、21.90 g/L和7.52 g/L。值得一提的是，乙醇的生产强度是对照（MTC培养基）的2倍。当酵母提取物与胰蛋白胨添加量分别达到10 g/L与5 g/L时，乙醇发酵性能无进一步提升，以上结果表明适量无机氮源添加能显著改善菌株生长和葡萄糖的利用。

图1 有机氮源添加对T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖发酵的影响

表1 有机氮源对T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖发酵产乙醇的性能比较

2.2 有机氮源添加对T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖发酵的影响

木糖是世界上除葡萄糖外第二丰富的碳源，也是木质纤维素水解液的主要成分[12-13]，因此本研究还考察了有机氮源对T.aotearoense SCUT27Δldh木糖发酵产乙醇的影响。结果如图2和表2所示，与葡萄糖发酵相比，菌株利用木糖的能力较弱，如MTC培养基中细胞生物量仅为1.99（葡萄糖发酵时生物量为2.62），底物消耗量和乙醇产量降低37%和41%，这一结果与木糖发酵产生较少ATP相一致。当酵母提取物添加浓度为1 g/L时，菌株生物量和乙醇生产无显著变化，说明菌株利用木糖发酵（相对于葡萄糖发酵）需要提供更为丰富的氮源。如预期的一样，继续增大酵母提取物浓度至4 g/L并添加2 g/L胰蛋白胨，T.aotearoense SCUT27Δldh OD600的生物量、木糖消耗量和乙醇浓度与对照（MTC培养基）相比，分别提高41%、50%和53%。与葡萄糖发酵类似，该条件下乙醇生产强度与对照相比提高了91%，且继续提高有机氮源添加对发酵性能提升无显著影响。

2.3 有机氮源添加对T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖发酵的影响

图2 有机氮源添加对T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖发酵的影响

表2 有机氮源对T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖发酵产乙醇的性能比较

图3 有机氮源添加对T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖发酵的影响

表3 有机氮源对T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖发酵产乙醇的性能比较

菌株T.aotearoense SCUT27Δldh的最大优势在于能利用木质纤维素水解液中的葡萄糖和木糖，即木糖的利用没有受到碳代谢阻遏的影响，因此最后本研究考察了有机氮源添加对T.aotearoense SCUT27Δldh混合糖（葡萄糖、木糖的比例为2∶1）发酵产乙醇的影响。发酵结果如表3和图3所示，以混合糖为底物发酵的结果与葡萄糖和木糖发酵基本一致，T.aotearoense SCUT27Δldh的生长，底物利用、乙醇产量和生产强度随有机氮源浓度的提高而提高。在最佳氮源（4 g/L酵母提取物与2 g/L胰蛋白胨）条件下，细胞生物量、乙醇产量、得率与生产强度分别为5.18、7.58 g/L、0.36 g/g、0.38 g/L·h。值得一提的是，在MTC培养基和低浓度酵母提取物添加的MTC培养基中，发酵起始阶段木糖的利用出现延迟（图3A和3B），但是这一现象随着氮源浓度的提高得到解决（图3C和3D），表明混合糖的高效共利用需要充足的氮源供给。

综上所述，无论是利用葡萄糖、木糖甚至是混合糖发酵，4 g/L酵母提取物与2 g/L胰蛋白胨对菌株的乙醇发酵性能促进均最为显著，且能有效提高乙醇生产强度和实现混合糖共利用。

3 结论

针对嗜热厌氧杆菌T.aotearoense SCUT27Δldh乙醇发酵存在生长能力较弱、糖耗速率慢与乙醇产量低等问题，本文致力于通过优化培养基的有机氮源组成和浓度来改善菌株的生长、提高乙醇生产和底物利用能力，具体结论如下。

（1）以葡萄糖、木糖和混合糖为碳源时，在培养基中添加4 g/L酵母提取物与2 g/L胰蛋白胨时，乙醇发酵性能最佳，生产强度提升91%～111%。

（2）T.aotearoense SCUT27Δldh对木糖的利用能力低于葡萄糖，因此菌株在木糖和混合糖发酵时，充足的氮源供给有利于乙醇发酵性能的提升、实现葡萄糖和木糖的高效共利用。