危永芳，周碧兰,2，吴沁璇，吴昭全，唐龙亮，周帅，黄晓珊,2＊

（1.长沙医学院药学院，湖南长沙 410219；2.长沙卫生职业学院，湖南长沙 410100）

白血病是一类造血干细胞异常增生性疾病，其死亡率高，是我国十大高发恶性肿瘤之一[1]。目前，化疗是治疗白血病的一种重要手段。Rosenberg等[2]研究表明，顺铂可作为白血病的治疗药物。顺铂通过作用于细胞内的DNA，干扰DNA的复制和转录，诱导细胞凋亡[3]，目前广泛用于临床上各种肿瘤的治疗。众所周知，线粒体是作为细胞的“动力工厂”，在细胞的生命活动中发挥着重要作用。正常情况下，线粒体分裂与融合处于动态平衡，这对于维持线粒体功能至关重要[4]。线粒体动力相关蛋白1（Drp1）是一种介导线粒体分裂的蛋白[5]，Drp1过表达可促使线粒体的分裂增多，导致线粒体碎片化。研究表明，线粒体分裂与融合动态过程失衡可能与肿瘤发生发展有关[6]。Caspase-3是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶，凋亡过程中最重要的事件之一即是Caspase-3的活化。本文通过研究Drp1抑制剂Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞Caspase-3活化及细胞凋亡的影响，探讨Drp1介导的线粒体分裂在顺铂抗白血病作用中的影响，期望进一步揭示线粒体动态变化对白血病顺铂耐药的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

L1210细胞株，购自武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。

胎牛血清（FBS），购自北京全式金生物技术有限公司；顺铂，购自北京四正柏公司；RPMI-1640培养基，购自美国Gibco公司；Mdivi-1，购自美国Sigma公司；Caspase 3抗体（兔），购自美国CST公司；台盼蓝，购自美国Sigma公司。

1.2 L1210细胞培养

L1210细胞培养于含10% FBS和1%双抗的RPMI-1640完全培养基中，在5% CO2、37 ℃培养箱中进行常规培养及传代。

1.3 台盼蓝染色法测细胞凋亡

取处于对数生长期的L1210细胞，调节至适当细胞密度，接种于6孔板中，分为对照（正常）组、DDP（顺铂）处理组、2.5 μmol/L Mdivi-1+DDP处理组、5 μmol/L Mdivi-1+DDP处理组、10 μmol/L Mdivi-1+DDP处理组；Mdivi-1+DDP处理组先加入对应终浓度的Mdivi-1预处理l h，再加入DDP。给药组加入终浓度为0.4 mg/L的DDP，处理48 h；收集细胞，细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液混合均匀（台盼蓝终浓度为0.04%），静置3 min，在倒置显微镜下观察细胞染色情况并计数，其中被染成淡蓝色的为死细胞，无色透明状细胞则为活细胞，计算细胞死亡率。

1.4 Western Blot检测Caspase-3的活性

取对数生长期的L1210细胞，分为对照组和不同浓度（0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L、2.00 mg/L、4.00 mg/L、8.00 mg/L和16.00 mg/L）顺铂处理组，分别用对应浓度的顺铂处理48 h；另取对数生长期的L1210细胞分为对照（正常）组、DDP（顺铂）处理组、2.5 μmol/L Mdivi1+DDP处理组、5 μmol/L Mdivi1+DDP处理组、10 μmol/L Mdivi1+DDP处理组；Mdivi-1+DDP处理组先加入对应终浓度的Mdivi-1预处理l h，再加入DDP。DDP处理组加入终浓度为8 mg/L的DDP，处理48 h。收集细胞，提取总蛋白，进行Western Blot实验，检测Caspase-3的活性。

2 结果与分析

2.1 Drp1抑制剂Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞凋亡有明显抑制作用

台盼蓝拒染法检测结果显示，与对照组相比，DDP处理组L1210细胞凋亡明显增多，而当提前1 h分别用不同浓度的Mdivi-1预处理时后，再用顺铂处理，细胞凋亡数量减少，说明Drp1抑制剂Mdivi-1能抑制顺铂诱导的细胞凋亡，其中5 μmol/L Mdivi-1的抑制作用最强（图1A和图1B）。结果表明，Drp1参与了顺铂诱导的L1210细胞凋亡。

图1 Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞凋亡的影响（＊＊P＜0.01）

2.2 Drp1抑制剂Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞Caspase-3活化有抑制作用

Western Blot法对细胞内Caspase-3的表达及活化情况检测结果显示，当顺铂浓度大于4 mg/L时可检测到明显的caspase-3活化（图2A）。8 mg/L DDP处理组Cleaved-caspase-3比例明显增多，Mdivi-1预处理组Cleaved-caspase-3比例有所降低，以5 μmol/L的Mdivi-1作用最明显（图2B）。该结果提示Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞Caspase-3活化有明显抑制作用，即Drp1参与了顺铂诱导的L1210细胞Caspase-3活化。

图2 Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞Caspase-3活化的影响

3 讨论

白血病作为国内十大高发恶性肿瘤之一，严重危害着人类的健康，化疗是其的重要治疗手段之一。顺铂作为第一个被FDA批准用于癌症治疗的铂类化合物，通过与DNA发生链内或链间交联反应，从而干扰DNA的转录和复制，诱导细胞凋亡，发挥其抗肿瘤作用，可用于白血病的治疗。线粒体作为细胞的“动力工厂”，为细胞的各项生命活动提供能量，在正常情况下线粒体的分裂/融合保持着平衡，分裂蛋白表达增加，融合蛋白表达减少，可促使线粒体分裂，并通过线粒体凋亡途径导致细胞凋亡[7]。Caspase-3作为线粒体凋亡通路下游的一种关键酶，在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。本研究显示，顺铂能诱导L1210细胞Caspase-3活化及细胞凋亡，而线粒体动力相关蛋白1（Drp1）的抑制剂Mdivi-1对顺铂诱导的Caspase-3活化和细胞凋亡有显著抑制作用（图1、2）。Drp1是一种介导线粒体分裂的蛋白，Drp1过表达可促使线粒体的分裂增多，导致线粒体碎片化。Frank等[8]研究表明，在凋亡诱导前抑制Drp1的活性不仅能减少线粒体分裂，还能延缓Caspase-3的活化及细胞死亡过程。

上述结果提示Drp1介导的线粒体分裂参与了顺铂抗白血病作用。然而顺铂与其他化疗药物相似，易产生耐药性。Santin等[9]研究发现，线粒体动态变化与顺铂获得性耐药的产生有关。结合本研究的结果，期望进一步揭示线粒体动态变化对白血病顺铂耐药的影响及机制。