张秀华，刘 飞, ，刘英梅，陈 勉，刘 霞，刘金明，凌沛学, ，王凤山

（1.山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室 山东省多糖类药物工程实验室 多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室 博士后科研工作站，山东 济南 250101；2.山东大学 药学院，山东 济南 250101；3.浙江赛灵特医药科技有限公司，浙江 杭州 311100）

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一种多功能生长因子，属于转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员，能诱导血管周围游动的未分化间充质细胞向骨系细胞方向转化，在骨骼（原位）或骨骼以外组织中（异位）产生新骨[1]。

目前己知的骨形成蛋白有30多种，许多BMP亚型已显示骨诱导活性，但其中研究最为充分的为BMP-2和BMP-7，且只有这两种骨形成蛋白被开发应用于临床，是与新骨生成关系密切、最有效的诱导骨再生的骨形态发生蛋白[2]。BMP在结构上类似，是由2 条多肽链通过二硫键结合的二聚体分子[3]，其特征是：由7个保守的半胱氨酸将整个分子折叠成一种独特的三维结构，称为胱氨酸结（cystine-knot），包含3对链内二硫键和一对链间二硫键。BMP 属于多功能细胞因子，研究证实BMP不仅与骨骼的形成有关，还与细胞的增殖、分化、凋亡、迁移有关，此外 BMP 还与组织器官的形成和发育如胚层的形成、肢体形成和心血管、呼吸、胃肠、泌尿及生殖、神经系统发生等基本的发育过程密切相关，在发育期和成年后的各个时期都有不同影响[4-6]，研究还证实 BMP与糖物质代谢有关[7]，可通过调控糖代谢过程中关键酶的表达、促进胰岛素合成及分泌、增加胰岛素敏感性等方式调节体内葡萄糖平衡。

BMP-2为疏水性酸性糖蛋白，由10余种氨基酸组成，水溶性差，酸性条件下稳定，二聚体形式为其活性形式。1996 年德国科学家Ruppert等用大肠杆菌系统成功获得有良好活性的rhBMP-2m，并就此在欧洲申请了专利，2002年7月美国食品和药物管理局（FDA）批准将rhBMP应用于脊柱融合[8-9]。美敦力公司产品Infuse®骨移植物随后上市。我国用大肠杆菌系统表达生产的rhBMP-2m也于 2004 年通过临床试验，以医疗器械的形式被批准生产投放市场，用于骨缺损的治疗。

由于提取困难且成本较高，目前BMP-2蛋白的生产多以基因工程方法在大肠杆菌中生产。但由于其疏水性较强，rhBMP-2在大肠杆菌中多以不溶性的包涵体形式表达，因此获得一株表达量高且复性方法简单、收率高的重组工程菌是近十几年研究的热点。本项目通过大肠杆菌密码子偏好性对密码子进行优化，构建了一株高效表达的产hBMP-2重组菌株。该菌株经高密度发酵后包涵体得量高，通过稀释复性法对包涵体进行复性，肝素柱亲和纯化方法对目的蛋白进行纯化，最终可得电泳纯蛋白。本项目中建立的方法简单易行，放大简单，适合工业化生产。

1 材料

1.1 试剂

限制性内切酶（NdeI，XhoI）（NEB）；T4 DNA连接酶（NEB）；蛋白质分子量标记（Fermentas）；PfuDNA 聚合酶（Fermentas）；PCR引物，DNA分子量标记，质粒抽提试剂盒（上海生工）；PCR产物纯化试剂盒（上海生工）；DNA胶回收试剂盒（上海生工）；肝素亲和层析柱（GE公司）；超滤膜（Millipore）；超滤管（Millipore）；碱性磷酸酶测定试剂盒（北京索莱宝）；骨优导（杭州九源）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 质粒与菌株

pET-28a(+)质粒，E.coliTop10，E.coliBL21（DE3）菌株及C2C12细胞均为本实验室保藏。

1.3 培养基

液体LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10；固体LB培养基含1.5 %～2 %琼脂粉；发酵培养基（g/L）：葡萄糖5，酵母提取物5，(NH4)2HPO44， KH2PO413.3，柠檬酸1.7，MgSO4·7H2O 1.2，微量元素：FeSO4·7H2O 1，CaCl20.2，ZnSO4·7H2O 2.25 g/L，MnSO4·4H2O 0.5，(NH4)6Mo7O240.1， Na2B4O7·10H2O 0.23 g/L，CuSO4·5H2O 0.1；补料培养基（g/L）：葡萄糖600，MgSO4·7H2O 20，酵母提取物100。

2 方法

2.1 基因的获得

查阅NCBI 数据库获得人BMP-2（Genebank P12643.1）成熟肽序列，碱基序列345 bp，编码115个氨基酸。根据大肠杆菌密码子偏好性对BMP-2成熟肽编码序列进行密码子优化，并分别在上下游两端添加NdeI、XhoI酶切位点，采用全基因合成方法获得优化后BMP-2基因。

2.2 BL21-pET28-rhBMP-2重组菌株的构建

PCR扩增得到BMP-2基因片段，纯化后与pET-28a(+)质粒分别用NdeI、XhoI进行双酶切，切胶回收后用T4 DNA连接酶连接，获得重组质粒pET28-rhBMP-2，CaCl2法转化E.coliTOP 10感受态细胞。阳性转化子经单酶切、PCR、测序验证正确后，提取pET28-rhBMP-2重组质粒，并转化E.coliBL21感受态细胞，得BL21-pET28-rhBMP-2工程菌株。

2.3 rhBMP-2重组蛋白的表达

工程菌株 LB液体培养基37 ℃振荡过夜培养后，以4 %接种量接种至含50 ml LB培养基的250 ml摇瓶中， 37 ℃培养4 h，加入终浓度为1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，并降温至28 ℃继续培养5 h。8000 r/min离心5 min收集菌体，用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬后进行超声破碎，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测目的蛋白表达情况。

按相同接种量，利用发酵培养基进行1 L发酵罐小试，控制发酵温度37 ℃，pH 7.0，溶氧25 %，当溶氧快速上升且转速快速下降时开始补料，添加IPTG进行诱导，诱导后降低温度至28 ℃。继续培养，发酵期间每隔12 h取样，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，确定最佳发酵时间。

2.4 rhBMP-2包涵体的复性

收集发酵菌体，超声破碎后12 000 r/min离心20 min得到包涵体，利用包涵体洗涤液（pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl ，0.5 mmol/L EDTA，2 % Triton X-100）反复洗涤包涵体3次。然后用包涵体裂解液[6 mol/L盐酸胍，pH 8.0 20 mmol/L Tris-HCl ，20 mmol/L二硫苏糖醇（DTT），1 mmol/L EDTA]将包涵体裂解为终浓度35 mg/ml。采用稀释复性法进行复性，复性液[1 mmol/L 氧化型谷胱甘肽（GSSG），2 mmol/L 还原型谷胱甘肽（GSH），pH 8.0 50 mmol/L Tris-HCl ，5 mmol/L EDTA，0.5 mol/LN-环己基-2-氨基乙磺酸（CHES）]中蛋白终浓度为500 mg/L，常温复性4 d，SDS-PAGE检测蛋白复性情况。

2.5 rhBMP-2蛋白的纯化

由于BMP-2前端序列中含肝素结合位点，可用肝素亲和层析柱对其进行纯化。亲和层析所用缓冲液为4 mol/L尿素、pH 8.0 20 mmol/L Tris，洗脱单聚体所用缓冲液为4 mol/L 尿素、 pH 8.0 20 mmol/L Tris、400 mmol/L NaCl，洗脱二聚体所用缓冲液为4 mol/L 尿素、pH 8.0 20 mmol/L Tris、800 mmol/L NaCl。收集有活性的二聚体部分，用pH 4.0醋酸盐缓冲液透析除盐，透析后样品真空冷冻干燥。

2.6 rhBMP-2细胞活性测定

生长良好的C2C12细胞按1×105个/孔接种于24孔板，37 ℃、5 % CO2预培养24 h，更换新鲜DMEM培养基并分别加入不同浓度rhBMP-2（500 ng/ml、1000 ng/ml），继续培养4 d，依照碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒说明检测ALP活性。以骨优导为阳性对照。

3 结果

3.1 基因的获得

采用PCR扩增BMP-2基因切胶回收片段进行1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。由图1可见扩增得到的目的基因片段长度约350 bp，与理论值一致。

图1 hBMP-2基因片段琼脂糖凝胶电泳检测结果

3.2 BL21-pET28-rhBMP-2重组菌株的构建

提取Top10-pET28-rhBMP-2质粒，XhoI单酶切、PCR验证的1.0 %琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图2可见，单酶切后的重组质粒大小约5.7 kb，与空质粒的差值与目的基因理论值一致。以重组子为模板，利用PCR扩增得到的目的基因，也与BMP-2基因大小相一致。测序结果也显示插入的序列与设计的序列完全一致。

图2 重组质粒pET28-rhB MP-2单酶切及PCR验证结果

3.3 rhBMP-2重组蛋白的表达

在摇瓶中对rhBMP-2蛋白进行表达，并进行超声破碎，SDS-PAGE检测，结果见图3。结果显示，超声破碎上清中空载体对照与重组菌分子量无明显区别；超声破碎沉淀中，与空载体对照相比重组菌在分子量约13 kD处有明显表达条带。说明rhBMP-2蛋白在重组菌中以包涵体形式表达。

图3 rhBMP-2表达情况SDS-PAGE分析

在1 L发酵罐中进行rhBMP-2蛋白的表达，分别在发酵4，17，29，41，53，65，77 h取样，将样品稀释至相同的菌体浓度，进行全菌SDS-PAGE分析，结果见图4。发酵4 h开始补料并诱导，蛋白质开始表达，发酵约29 h时目的蛋白表达量达最大，目的蛋白占胞内总蛋白比例最高。随着发酵时间延长，目的蛋白占胞内总蛋白比例下降，但菌体密度增加，因此综合考虑蛋白含量与菌体量及成本等因素，进行大规模发酵时可控制蛋白表达时间在40 h左右。发酵结束后菌体经破碎、洗涤后称重，1 L发酵罐中rhBMP-2包涵体湿重可达20 g/L。

图4 rhBMP-2 1 L发酵罐中表达蛋白SDS-PAGE分析

3.4 rhBMP-2包涵体的复性检测

非还原SDS-PAGE电泳检测包涵体复性情况见图5，通过灰度扫描确定复性率。结果显示方法2.4项下复性液可有效复性包涵体，蛋白复性率达40 %以上。

3.5 rhBMP-2蛋白的纯化

利用肝素亲和层析柱对复性液纯化，层析图谱见图6，峰1为穿透峰，峰2为400 mmol/L NaCl洗脱峰，峰3为800 mmol/L NaCl洗脱峰。分别收集穿透峰和洗脱峰，进行非还原SDS-PAGE电泳，检测二聚体纯化情况，结果见图7。

图5 rhBMP-2复性蛋白电泳图

峰1为穿透峰，几乎无蛋白质流出，说明肝素柱能有效地与蛋白质结合；峰2为单聚体，洗脱液中绝大部分蛋白质为分子量小的单聚体；峰3为二聚体，洗脱液中二聚体蛋白纯度达95 %以上，说明该条件下单聚体与二聚体可有效分离。为确认蛋白二聚体形式，将收集的峰3样品分别加入含DTT和不含DTT的蛋白上样缓冲液进行电泳，分别对应泳道4、5。由图7可见加入还原剂DTT后二聚体被还原成了单聚体，间接说明了该蛋白的二聚体形式。

图6 rhBMP-2肝素亲和层析图谱

图7 rhBMP-2纯化结果SDS-PAGE分析

3.6 rhBMP-2细胞活性测定

C2C12细胞是成肌干细胞，在BMP-2作用下可向成骨细胞分化，分化后的成骨细胞可表达C2C12细胞内没有的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），因此ALP是成骨细胞的标志性酶，该检测方法已成为BMP活性检测的基本方法。

纯化后的rhBMP-2活性结果见图8。结果显示制备的rhBMP-2具有与市售产品骨优导相同的生物活性，能有效诱导C2C12细胞向成骨细胞分化，产生特异性ALP。

图8 rhBMP-2与对照样品骨优导生物活性比较

4 讨论

本项目中构建的hBMP-2重组工程菌表达量高，1 L发酵液可得高纯度包涵体20 g。王馥丽等[10]认为包涵体的纯度会影响复性效果，需先对包涵体进行纯化再裂解、复性，但本研究发现无需额外纯化，经简单洗涤后即可对包涵体进行裂解复性，且复性效率大于40 %，优于上述文献报道的31 %。本研究为了得到高纯度的二聚体进行后续实验研究，采用亲和层析对BMP-2进行纯化，实验也证实经亲和层析一步纯化后，可将未复性的单体和复性成功的二聚体分离，且分离得到的二聚体纯度在95 %以上，大大降低了工业生产成本。

本项目纯化得到的二聚体溶液利用透析除盐，超滤浓缩后再经冷冻干燥，每升发酵液最终可得有活性的二聚体蛋白大于100 mg。冻干后的样品经活性检测具有与市售产品骨优导相同的生物活性，可与药用明胶、大豆磷脂、羟基磷灰石等载体复合，进行新产品的开发，最终以医疗器械的形式生产投放市场，用于骨缺损的治疗。