陈高峰 马园园 陶艳艳

临床与实验研究中，研究人员习惯将组织切片保存在室温条件下，有研究初步发现，组织切片室温保存6个月部分抗体检测不出阳性结果，这提示组织切片室温下保存可能导致抗原丢失[1]。但是组织切片室温保存不同时间抗原是否丢失？不同部位抗原丢失是否一致？组织切片蜡封后是否能减少抗原丢失？针对上述问题，我们采用纤维化肝组织蜡块连续切片，室温条件下放置0、24、48与96周时浸蜡封片，免疫组化染色观察细胞膜、细胞浆、细胞核三个不同部位抗原表达变化，用于指导临床与实验研究中组织切片保存。

资料与方法

一、实验动物

Fisher344 18只，雄性，SPF级，体质量160～180 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001，饲养于上海中医药大学实验动物中心，设施许可证号：SYXK(沪)2009-0069。所有动物均自由饮食饮水。

二、主要试剂

四氯化碳(CCl4)，化学纯，批号20140325；橄榄油，化学纯，批号F20140402，购自国药集团；二乙酰氨基芴(2-Acetamidofluorene，2-AAF)，Lot#：SLBJ2755V，购自sigma；天狼猩红试剂，货号G1470购自Solarbio；HE试剂，货号D005-1，购自南京建成；免疫组化Ⅰ抗：CK7，货号ab181598；Hedgehog信号通路配体蛋白(sonic hedgehog，SHH)，货号ab73958；肝细胞标志物(Hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF 4α)，货号ab216897。Ⅱ抗：小鼠与兔HRP/DAB (ABC)检测试剂盒，货号ab64264，均购自abcam公司。

三、研究方法

(一)模型制备 大鼠适应性饲养1周后，用30% CCl4/橄榄油溶液2 mL·kg-1皮下注射，每周2次，共计6周；第7周开始，模型继续30% CCl4皮下注射的同时添加10 mg·kg-1·d-12-AAF灌胃3周，共9周，建立2-AAF/ CCl4大鼠肝纤维化模型。

(二)样品的采集和处理 造模9周结束，2%戊巴比妥钠2 mL·kg-1腹腔注射麻醉，仰卧位固定，打开腹腔。经下腔静脉采血后从肝右叶切取1.5 cm × 1.0 cm × 0.5 cm大小肝组织1块，10%甲醛溶液固定，脱水、包埋，用于HE、胶原及免疫组化染色。

(三)肝组织石蜡切片保存 每例肝组织石蜡块连续切片12张，分成3组(分别用于HE、天狼猩红胶原与免疫组化染色)，每组4张(用于设0、24、48、96周共4个不同时间点)。切片于常温空气中放置0、24、48、96周时浸蜡封片；96周时切片统一脱蜡至水进行HE染色、天狼猩红胶原染色及免疫组化染色(细胞膜蛋白胆管上皮细胞标志物CK7、细胞浆蛋白SHH，细胞核蛋白肝细胞标志物HNF 4α)，观察肝组织炎症、胶原沉积与不同部位组织细胞抗原表达变化。

(四)肝组织HE与天狼星红胶原染色 肝组织经中性甲醛缓冲液固定，石蜡包埋。HE染色：石蜡切片，切片为4 μm厚度，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水水洗3～5 min，Harris苏木素液染 15 min，自来水洗3～5 min，5%盐酸酒精分化10 s，水洗蓝化 3～5 min，镜检细胞核，伊红复染10 s，梯度脱水，二甲苯透明，封片。天狼猩红胶原染色：石蜡切片，切片为4 μm厚度，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水水洗3～5 min，天狼星红染色液滴染15 min，无水乙醇分化，二甲苯透明，封片。胶原染色阳性面积分析：采用OlympusDP71显微数码CCD采集图片，用Image-Pro Plus 6.1进行肝组织胶原面积半定量分析。

(五)肝组织免疫组化染色 肝组织石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3次各5 min，新鲜配制的3%H2O2，37 ℃封闭10 min，PBS洗3次各5 min；抗原修复(微波柠檬酸修复)把切片放入置有柠檬酸的缓冲液中100 ℃ 10 min，自然冷却；PBS洗3次各5 min；滴加5% BSA封闭液，37 ℃ 10 min，甩去多余液体；滴加一抗50 μL，4 ℃过夜；PBS洗3次各5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃ 30 min；PBS洗3次各5 min；滴加试剂SABC 37 ℃ 10 min；PBS洗3次各5 min；DAB显色，苏木素染核，脱水、透明、封片、镜检。免疫组化染色阳性面积分析：采用OlympusDP71显微数码CCD采集图片，用Image-Pro Plus6.1进行肝组织阳性表达面积半定量分析。

四、统计学方法

所有数据均采用SPSS 15.0进行统计分析，计量资料用表示，符合正态性和方差齐性的数据用配对t检验，不符合正态性或方差齐性的数据用非参数检验。

结 果

一、肝组织细胞膜、细胞浆与细胞核抗原表达变化

免疫组化染色结果显示，CK7蛋白表达于胆管上皮细胞，应用ImagePro Plus软件半定量分析显示，0周时CK7阳染面积为12.70%±0.90%；24周时显著减少至9.02%±0.61%，为0周的71.02%(P<0. 05)；48周时显著减少至5.97%±0.57%，为0周的47.01%(P<0. 05)；96周时显著减少至4.28%±0.61%，为0周阳染面积的33.70%(P<0.05)；见图1、表1。

SHH蛋白抗原表达于肝细胞浆，应用Image-Pro Plus 6.1软件半定量分析显示，0周SHH阳染面积为45.44%±6.11%；24周时显著减少至22.44%±2.45%，为0周的49.38%(P<0.05)；48周时显著减少至11.96%±1.24%，为0周的26.32%(P<0.05)；96周时显著减少至9.44%±1.07%，为0周SHH阳染面积的20.77%(P<0.05)；见图2、表1。

HNF-4ɑ蛋白抗原表达于肝细胞核。应用ImagePro Plus 6.1软件半定量分析显示， 0周HNF-4ɑ阳染面积占9.38%±0.62%；24周时显著减少至4.48%±0.55%，为0w点的47.76%(P<0.05)；48周时显著减少至1.36%±0.33%，为0周的14.50%(P<0.05)；96周时显著减少至1.07%±0.06%，为0周HNF-4ɑ阳染面积的11.41%(P<0.05)；见图3、图4。

注：A：0周；B：24周；C：48周；D：96周

图1肝组织切片室温不同放置时间CK7免疫组化染色、HE染色与天狼猩红胶原染色变化(×200)

注：A：0周；B：24周；C：48周；D：96周

图2肝组织切片室温不同放置时间SHH免疫组化染色、HE染色与天狼猩红胶原染色变化(×200)

二、肝组织炎症和胶原沉积变化

HE染色结果显示，模型组肝小叶结构紊乱，小叶内肝细胞疏松，散在的少量点状坏死，汇管区大量炎症伴中度界面炎，偶见浆细胞浸润，纤维组织增生，纤维间隔形成。HE染色显示，0～96周不同时间点肝组织炎症病理无明显改变。见图1、2、3。

天狼猩红染色结果显示，模型大鼠肝脏胶原纤维增生明显，大量纤维间隔向小叶内延伸，可见汇管区间(P-P)纤维间隔和汇管区-中央静脉(P-C)纤维间隔形成，部分有明显的纤维间隔和再生结节。应用ImagePro Plus软件半定量分析显示，与0周相比，肝组织切片室温放置24、48、96周不同时间，CK7染色组、SHH染色组与HNF-4ɑ染色组胶原面积率均逐渐减少，96周胶原面积显著减少至0周的73.76%、74.44%与64.54%。见图1～3与表1。

注：A：0周；B：24周；C：48周；D：96周

图3肝组织切片室温不同放置时间HNF-4ɑ免疫组化染色、HE染色与天狼猩红胶原染色变化(×200)

讨 论

免疫组化是应用免疫学抗原抗体反应的基本原理，对组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)进行定位、定性及定量的研究方法[2]。随着免疫组化技术在病理诊断/疗效判断、基础医学研究中的广泛应用，其结果的可靠性、重现性愈来愈受到重视。组织固定、切片保存、染色前处理及染色中的实验操作，任何一个环节出现问题，都可能直接影响免疫组化染色，从而影响诊断或科研结果的准确性。因此许多专家提出重视免疫组化的质量控制和标准化，包括组织取材和固定、石蜡切片保存时间、方法和温度、组织封闭和抗原修复等质量控制[3-4]。

组织切片存储于室温条件下是否抗原会丢失？这一直是困扰着我们的一个问题。本研究中，组织切片分别于室温条件下放置0、24、48、96周时浸蜡封存，96周时统一脱蜡至水后开展HE、天狼猩红及免疫组化染色。随着组织切片放置时间延长至96周，胶原面积显著减少至0周的64.54～74.44%；随着时间延长，CK7阳染面积从0周12.70%下降至96周时的4.28%，仅占0周的33.70%； SHH阳染面积从0周45.44%下降至96周时的9.44%，仅占0周SHH的20.77%%；与0周相比，96周点细胞核抗原HNF 4ɑ仅微弱表达，仅为0周的11.41%。上述结果提示，随着切片室温放置时间延长至96周时，胶原面积约为0周时点的70%；组织细胞抗原在24周时已经出现明显丢失，至96周损失更为严重，尤其核抗原丢失更为突出，究其原因可能与空气中氧化作用有关。

表1 肝组织细胞抗原阳染率与胶原面积率变化(%)

注：与0周相比，#P<0.05,##P<0.01

本研究中切片室温放置时间延长，胶原与抗原表达均逐渐减少，但抗原丢失更为突出。胶原是细胞外基质主要蛋白质成分，纤维胶原的分子结构特征是由3条左手螺旋α肽链绞合成右手旋转的超三螺旋，结构稳定[5]，这也可能是胶原丢失没有组织细胞抗原损失明显的原因。有研究者提出[6]，若要长期保存组织切片等生物样本应放入-20℃及以下低温保存，但低温条件会受到场地设备等条件限制；本研究采用纤维化肝组织连续切片，分别于室温条件下放置0～96周时石蜡封固切片，结果提示组织切片石蜡封固可以避免抗原损失。所以在实际工作中可以采用来避免抗原损失以便长期保存，这就可以大大降低抗原丢失率，用于指导临床与实验研究中组织切片保存。