窦冬冬 张楠 潘峰

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)在人类中感染率非常高，我国一般人群HCMV抗体阳性率为86%～96%，婴幼儿期为60～80%。国外报道先天性HCMV感染的发生率约为0.2%～2.0%[1-2]，国内约为0.2%～0.5%[3]。母亲孕期将HCMV 传播给胎儿，轻则隐性感染，重者可造成流产、死胎、畸形、生长受限等不良结局。诸多报道显示，HCMV是婴儿肝炎综合征(Infant hepatitis syndrome，IHS)的主要致病因素[4-6]，然而对于先天性感染HCMV的患者其病毒对肝脏的损伤研究较少，临床上常因症状隐匿或迟发，不易引起重视而错过干预止损的最佳时机。因此，本研究通过HCMV感染孕鼠，建立先天性HCMV感染的子鼠模型，观察其肝脏组织病理学改变，并检测相关血清学指标，为进一步认识先天性HCMV感染对肝脏的早期损伤和早期诊断防治提供参考。

资料与方法

一、一般资料

30只SPF级Wistar大鼠[体质量(200±20)g，购自山东中医药大学实验动物中心]适应性喂养1周后，按雌∶雄=2∶1配对，见栓孕鼠随机分为感染组和对照组，每组10只(每只单笼饲养)。见栓后2～5 d，感染组大鼠腹腔内接种HCMV-AD169病毒悬液(0.1 mL/只)，对照组腹腔内接种等量的人胚肺细胞上清液(0.1 mL/只)，待其分娩并观察各组孕鼠及子鼠一般情况。新生子鼠饲养1周后，每笼各取2只(每组20只)进行心脏采血，EDTA抗凝，用于检测HCMV感染情况。其余子鼠分别于3、5、7周时每组各随机选取10只心脏采血，留取血清分装后于-80 ℃冰箱保存。同时留取相应时期肝组织，制作石蜡切片备用。

二、方法

(一)HCMV DNA检测 采用核酸扩增荧光定量检测方法，抗凝血液标本分离淋巴细胞并提取DNA，各取上清液5 μL(含病毒DNA)离心后分别加入若干HCMV-PCR反应管，设置PCR程序：93 ℃→2 min预变性，然后按93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s，10个循环，最后按93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30个循环。同时设置阴性质控品和阳性定量质控参考品梯度，记录数据。检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。

(二)病理学检查 对生后3、5、7周时两组随机选取的新鲜子鼠肝脏组织迅速固定、常规脱水及石蜡包埋，切片、烤片，进行HE染色，于光镜下观察肝组织普通病理。

(三)检测血清ALT、肝纤维化指标水平 分别于3、5、7周时应用全自动生化分析仪检测血清ALT水平。应用大鼠透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ.C)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(均购自北京科硕生物技术有限公司)按照说明检测血清肝纤维化指标。在反应板样品孔(设有空白)中加入不同浓度的待测样品和标准品，37 ℃孵育120 min，再用洗涤液洗涤4～6次并扣干，加入一抗工作液混匀再次温育、洗涤干燥、避光反应、加终止液检测吸光值并换算相应含量。

(四)免疫组化检测肝脏组织α-SMA蛋白的表达 对石蜡切片进行处理并采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物免疫组化试剂盒进行免疫细胞化学染色，一抗(武汉博示德生物技术有限公司)工作浓度均为1∶500，阴性对照为磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。结果判定：胞浆内出现棕黄色颗粒为α-SMA阳性表达。

三、统计学方法

数据统计分析采用SPSS 20.0 软件。计量资料以均值±标准差表示，两组比较采用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、实验动物一般状况及子鼠HCMV检测

(一)一般情况 感染组孕鼠注射病毒悬液后，有萎靡、耸毛、活动减少或躁动、食量减少等表现，子鼠成活率低，皮毛稀疏缺乏光泽，生长发育稍有缓慢，对照组孕鼠及子鼠一般情况良好。

(二)子鼠HCMV检测 感染组HCMV阳性率为75.0%(病毒载量范围4.05×103～4.84×107拷贝/mL，平均值4.67×105拷贝/mL)，对照组未见阳性子鼠。先天性人HCMV感染子鼠模型制作成功。

二、肝组织HE染色普通病理镜检

感染组子鼠生后3、5、7周时见肝小叶结构紊乱，肝索解离，细胞水肿、变性、坏死，大量淋巴细胞浸润，肝窦充血明显。对照组子鼠肝组织病理见肝细胞及肝小叶结构清晰正常，无淋巴细胞浸润，肝窦无充血(图1)。

三、血清ALT与肝纤维化指标水平

感染组子鼠在生后3、5、7周，血清ALT、肝纤维化指标水平均表现为高于同时期对照组子鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1～表3。

图1 肝组织HE染色病理结果

表1 各组子鼠血清ALT测定(±s，IU·L-1)

表2 各组子鼠血清HA、LN测定(±s，ng·mL-1)

表3 各组子鼠血清PCIII、IV.C测定(±s，μg·mL-1)

四、肝组织α-SMA 蛋白表达水平

感染组子鼠3、5、7周肝组织汇管区及增生的纤维组织中α-SMA强阳性表达，肝窦内及肝细胞亦可见阳性表达细胞；对照组子鼠α-SMA主要表达与小动脉及小静脉，且表达量低(图2)。

图2 肝组织α-SMA表达及分布

讨 论

HCMV属于疱疹病毒组DNA病毒，有广泛的细胞嗜性，普遍易感于人体的多种细胞，可使受感染细胞出现直接损伤；另外，病毒引起的机体免疫病理反应可累及多个器官或系统。本研究中先天性HCMV感染的子鼠出现了一般状况不良的表现，如存活率低、皮毛稀疏缺乏光泽，生长发育稍有缓慢等。

本研究观察了先天性HCMV感染的子鼠肝脏病理学改变，结果发现肝组织出现明显的肝炎样改变。因肝活检有创性的特点，少有关于HCMV感染者病理学改变的研究报道。龙梅等[7]曾对50例IHS婴儿(34例感染HCMV)行B超介导的肝活检病理检查，所有患者均存在肝细胞水样、气球样变性以及点、灶性坏死和凋亡小体的形成等表现。与本实验中先天性HCMV感染的子鼠肝病理学改变类似，表明先天性HCMV感染确实对肝脏具有损伤作用。

血清ALT 和肝纤维化指标是反映肝功能受损，衡量炎症活动度、纤维化程度的重要指标。在各种病毒性肝炎的急性期、药物中毒性肝细胞坏死时，ALT可大量释放入血从而被检测到。血清肝纤维化指标常被用来间接反映纤维化的程度和辅助诊断，多项报道显示，患HCMV感染性肝炎的婴儿血清ALT和肝纤维化指标水平均高于健康婴儿[6,8]，本研究也发现，先天性HCMV感染的子鼠血清ALT、HA、LN、IV-C、PCIII在肝脏发生损伤的早期即可有显著升高，可能预示着肝脏的纤维化改变。肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)在致病因素的作用下激活并转化为肌成纤维细胞(Myofibroblast，MF)，后者表达α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，是肝脏纤维化发生过程中的重要标志蛋白[9]。本研究检测的感染组子鼠肝组织α-SMA水平高于对照组，提示先天性HCMV感染的子鼠肝脏可能正在发生纤维化改变，也与血清肝纤维化指标结果的意义相符。

综上，先天性HCMV感染可导致一般状况发育不良、肝功能受损及纤维化等病理损伤，且在生命早期即可检测到血清标志物的改变。因此，降低母亲孕期感染概率、避免胎儿受到HCMV的感染非常重要，另外，可以通过血清学等手段做好疾病的早期诊断和治疗，避免产生不可逆的肝脏病理变化，改善预后。