周猛 梁园园 曲晨菲 翟艺 张涛 亓文倩 张竞竞 岳启安

临床上发生面颈部顽固性细菌感染的患者以青少年多见，该病对药物耐药性较强，易反复感染，缺乏理想的治疗方法，严重影响青少年的身心健康。我们首次在临床上使用多价葡萄球菌菌苗治疗1 195 例面颈部顽固性细菌感染患者，一次性治愈率可达75%左右，具有较理想的治疗效果[1]。为探讨该药物的作用机理，本研究分析多价葡萄球菌菌苗对小鼠白细胞介素-2 受体（IL-2R）、肿瘤坏死因子受体（TNF-αR）基因表达及血清IL-2 水平的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 PCR 仪（TC-XP，博日科技），凝胶成像系统（Tanon-1600R，上海天能），低温离心机（Neofuge 13R，上海力申），-80℃超低温冰箱（海尔），酶标仪DNM-9602A（北京普朗新技术有限公司）。多价葡萄球菌菌苗[2～4]；RNA 提取与基因扩增试剂盒购于上海生工；检测小鼠IL-2 的ELISA 试剂盒购于青岛捷世康公司；SD 昆明种小鼠购于青岛市药检所。

1.2 小鼠动物试验 随机选取健康SD 昆明种小白鼠40 只，体重22～24g，随机分成4 组，雌雄混合，放饲养笼内单独饲养，喂养标准特制的混合饲料，并供应充足的自来水。分为对照组、低剂量组（5 亿个/ml 细菌）、中剂量组（10 亿个/ml 细菌）、高剂量组（20 亿个/ml 细菌），每组10 只小白鼠，小白鼠腹腔内无菌注射，实验组按不同组别每只每次注射1ml菌液，正常对照组每只每次注射生理盐水1ml。注射疗程：1、3、6、9、14日为全疗程，最后一次于第14天实验前1h 每组先注射无菌肉汤1ml，再注射细菌1ml（中剂量），并轻柔腹部，注射30min 后以颈动脉放血方法处死。用小剪刀剪开腹部，再用无菌小剪刀将小鼠脾脏和肝脏剪除，放电子天平的无菌玻璃纸上称重，然后放-80℃超低温冰箱保存。

1.3 RNA 提取 取脾脏组织块（30～50mg）在玻璃匀浆器中研磨粉碎，将玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆，移入1.5ml 离心管，用5ml 针头抽打，冰上放置5min，放置4℃离心机，12 000r/min 离心5min。取上清液至1.5ml 新离心管，加0.2ml 氯仿，震荡，冰上孵育5min，＜12 000r/min，4℃离心10min，取上清液移入1.5ml 新离心管，加0.5ml 异丙醇，震荡，＜12 000r/min，4℃离心5min，弃去上清液，加入1ml 75%乙醇，震荡，＜7 500r/min，4℃离心5min，弃去上清液，室温下使之变透明，加入DEPC 水20μl 溶解RNA（放低温冰箱保存）。

1.4 小鼠脾脏 IL-2R、TNF-αR 基因扩增

1.4.1 RNA 逆转录合成cDNA 将1μg RNA 与1μl Oligo（dT）18 引物混合，65℃ 10min，冰浴1～2min，加入4μl 5×buffer、1μl dNTP（2.5mM）、Rnasin 1μl、逆转录酶0.5μl（20μl）、去离子水15.5μl。将上述反应体系在42℃温育60min，进行cDNA 的合成，70℃ 5min 灭活逆转录酶，冰浴4min，-20℃保存。

1.4.2 PCR 扩增 设计IL-2R 和TNF-αR 编码基因的引物序列，IL-2R 上游引物：5'-AACGGCACCATC CTAAACTG-3'；IL-2R 下游引物：5'-ACACTCTGTC CTTCCACGAAA-3'；TNF-αR 上游引物：5'-GTTGT CAATTGCTGCCCTGT-3'；TNF-αR 下游引物：5'-T AATTTGCAAGCGGAGGAG-3'；β-actin 上游引物：5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'；β-actin下游引物：5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'。cDNA模板2μl加入10×buffer 5μl、1～4μl dNTP（2.5mM）、3μl MgCl2（25mM）、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq 酶0.2μl（5μl）、加去离子水补至50μl。在50μl的PCR 体系中加入石蜡油30～50μl，将反应管置于PCR 仪内，按下列条件进行PCR 反应：94℃预变性5min，然后94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，共进行42 个循环。扩增结束后，用电泳仪测定PCR 扩增产物，用凝胶成像系统测定电泳产物条带及产物含量。

1.5 用ELISA 法测定血清中IL-2 含量 免疫结束后，以无菌法分别取各组血液于无菌试管中，待血液凝固后2 000r/min 离心10min，取血清放低温冰箱保存，按照ELISA 试剂盒说明书用酶标仪测定IL-2 的含量。

1.6 统计学分析 应用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以±s表示，两组样本间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏重量的影响 低剂量组、中剂量组和高剂量组与对照组比较，小鼠脾脏重量差异均有统计学意义（P＜0.05），最佳剂量组为中剂量组，而低剂量组和高剂量组不但没有增加脾重，反而抑制了脾重，见表1。

表1 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏重量的影响（±s）

表1 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏重量的影响（±s）

注：各剂量组分别与对照组比较

组别 数量（只） 脾重（g） t P对照组 10 0.052±0.011低剂量组 10 0.035±0.001 -3.89 ＜0.05中剂量组 10 0.498±0.068 22.63 ＜0.05高剂量组 10 0.030±0.003 -5.429 ＜0.05

2.2 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏IL-2R 基因表达的影响 低剂量组、中剂量组和高剂量组与对照组比较，小鼠脾脏IL-2R 基因表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05），而中剂量组与低剂量组和高剂量组比较，差异也有统计学意义（t=34.20，P＜0.05；t=31.97，P＜0.05），以中剂量组效果最佳，见表2。

表2 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏IL-2R 基因表达的影响（±s）

表2 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏IL-2R 基因表达的影响（±s）

注：各剂量组分别与对照组比较

组别 数量（只） 灰值 t P对照组 10 1.54±0.03低剂量组 10 5.63±0.09 20.38 ＜0.05中剂量组 10 13.09±0.14 33.36 ＜0.05高剂量组 10 4.40±0.14 24.48 ＜0.05

2.3 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏TNF-αR 基因表达的影响 低剂量组、中剂量组和高剂量组与对照组比较，小鼠脾脏TNF-αR 基因表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05），而中剂量组与低剂量组和高剂量组比较，差异也有统计学意义（t=47.96，P＜0.05；t=30.88，P＜0.05），以中剂量组效果最佳，见表3。

表3 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏 TNF-αR 基因表达的影响（±s）

表3 多价葡萄球菌菌苗对小鼠脾脏 TNF-αR 基因表达的影响（±s）

注：各剂量组分别与对照组比较

组别 数量（只） 灰值 t P对照组 10 1.50±0.10低剂量组 10 8.33±0.27 8.44 ＜0.05中剂量组 10 13.87±0.40 113.78 ＜0.05高剂量组 10 9.71±0.39 76.24 ＜0.05

2.4 多价葡萄球菌菌苗对小鼠血清中IL-2 含量的影响 低剂量组、中剂量组和高剂量组与对照组比较，小鼠血清中IL-2 含量差异均有统计学意义（P＜0.05），中剂量组与低剂量组和高剂量组比较，差异也有统计学意义（t=3.76，P＜0.05；t=7.14，P＜0.05），以中剂量组效果最佳，见表4。

表4 多价葡萄球菌菌苗对小鼠血清IL-2 含量的影响（±s，ng/ml）

表4 多价葡萄球菌菌苗对小鼠血清IL-2 含量的影响（±s，ng/ml）

注：各剂量组分别与对照组比较

组别 数量（只） IL-2 含量 t P对照组 10 0.25±0.03低剂量组 10 0.34±0.03 10.28 ＜0.05中剂量组 10 0.36±0.03 15.65 ＜0.05高剂量组 10 0.29±0.02 4.44 ＜0.05

3 讨论

面颈部顽固性细菌感染多由耐药性葡萄球菌感染引起，由于多数致病性的葡萄球菌产生血浆凝固酶，使感染局部周围的血浆发生凝固，药物不易渗透到炎症内部，使局部或全身性抗生素治疗效果不佳。在之前的研究中我们使用多价、不同比例、高浓度葡萄球菌菌苗对1 195 例顽固性头颈部感染性皮肤病患者进行治疗，40d 为1 个疗程，一次性治愈率达到75%左右，有效率达到95%以上，获得了较理想的治疗效果，深受青少年患者的欢迎[2～4]。经多价葡萄球菌菌苗治疗后效果明显而持久，无明显副作用。为探讨该药物的作用机理，本研究采用不同剂量的多价葡萄球菌菌苗免疫小鼠后，检测小鼠脾脏重量，脾脏IL-2R、TNF-αR 基因表达及血清IL-2 含量的变化。经过免疫后的3 个实验组中，脾脏增重、IL-2R、TNF-αR 基因表达和血清中IL-2 浓度都以中剂量效果最显著，中剂量组与其他各剂量组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），显示具有明显的剂量依赖关系。Th1 细胞主要介导细胞毒性和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的发生，通过分泌IL-2 细胞因子促进Th1 细胞进一步增殖。因此，IL-2 在血清中含量增多，可以诱导活化T 细胞、NK 细胞的增殖与分化，增强TC、NK 细胞和吞噬细胞的活性，更有利于清除局部感染的病原菌，加快局部组织的修复[5～8]。同时IL-2 可作为治疗肿瘤的辅助药物[9～11]，提高人体免疫力，增强对肿瘤细胞的杀伤能力。TNF-α是单核巨噬细胞分泌的一种细胞因子，除了具有抗肿瘤作用外，可在局部诱发炎症作用和免疫调节作用，吸引中性粒细胞到炎症局部，增强吞噬细胞的吞噬作用[12]。

本研究表明，多价葡萄球菌菌苗治疗面颈部顽固性细菌感染，主要是增强了T 细胞介导的细胞免疫，通过增加血清IL-2 含量和脾脏IL-2R 基因的表达，更有利于刺激T 细胞的进一步活化，产生更多的IL-2 释放到体液中，提高了吞噬细胞的杀伤活性。TNF-αR 基因的表达可增强单核吞噬细胞分泌TNF-α细胞因子，诱发局部的炎症反应和免疫调节作用，吸引中性粒细胞到炎症局部，从而可以明显增强小鼠的细胞免疫功能，提高炎症局部的吞噬细胞数量和增强吞噬细胞的吞噬功能，最终起到抗感染的作用。