北京市药品检验所 中药成分分析与生物评价北京市重点实验室（102206）赵璇 李群 周长明

牛肺表面提取物质是从牛肺中提取的天然肺表面活性物质，是一种成分复杂的混合物，其制剂常用于治疗新生儿呼吸窘迫症[1]，又称为肺透明膜病，多见于早产儿，是较为严重的低氧血症，致残率与致死率均较高。牛肺表面提取物质在生产过程中使用了甲醇、丙酮等溶剂，而药品中的残留溶剂会增加药物的毒副作用[2]。其中，“甲醇”为二类溶剂、“丙酮”为三类溶剂，均需严格控制[3]。《中国药典》对此类残留溶剂的含量也作出限制。本品现行的质量标准较为陈旧，残留溶剂的方法还采用填充柱、外标法、直接进样的气相色谱方法，存在一定的局限性，灵敏度低，重现性差。建立了新的检测方法，甲醇、丙酮的检测采用顶空毛细管色谱法，内标进行测定。经方法学验证，实验结果显示，新建立的方法灵敏度，重现性高，精密度好，结果准确可靠，可用于生产中的监控，也可用于质量检测。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent6890型气相色谱仪；Agilent7694型顶空进样器；氢火焰离子化检测器（FID）。LC-solution色谱工作站。色谱柱DB-624（60m×0.54mm，3μm）（安捷伦公司）。

1.2 试药 牛肺表面提取物质（北京双鹤现代医药技术有限责任公司，批号为2010.6.1）；甲醇（纯度99.5%），丙酮（纯度100%）（北京化学试剂公司）均为色标。

附图 气相色谱图；A.对照溶液；B.供试品溶液；1.甲醇；2.丙酮；3.内标；4.N,N-二甲基甲酰胺

2 甲醇、丙酮残留溶剂的测定方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：DB-624（60m×0.54mm，3μm）；柱温：采用程序升温，初始柱温50℃，保持16分钟，以每分钟10℃的速率升温至200℃，保持5分钟；进样口温度为230℃，检测器温度：250℃；顶空瓶平衡温度90℃，平衡时间30分钟，进样1.0min。载气：氮气；流速：1ml/min；分流比：10∶1。

2.2 对照品溶液及内标溶液配制 取甲醇对照品80mg、丙酮对照品130mg，精密称定，置50ml量瓶中，用内标溶液稀释并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取5ml，置100ml量瓶中，用内标溶液稀释并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取正己烷12mg，精密称定，置500ml量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺稀释并定容至刻度，摇匀作为内标溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品25 mg，精密称定，置顶空进样瓶中，加内标溶液1.0ml，迅速加盖密闭，超声1分钟，作为供试品溶液。

2.4 系统适用性试验 将对照品溶液1ml，置顶空进样瓶中，密封进样，各峰与相邻色谱峰分离度均大于18.5。另取供试品溶液进样，色谱结果见附图。

2.5 线性关系考察 精密量取对照品储备液用内标溶液逐级稀释，制成系列质量浓度的溶液，精密量取各溶液1ml，置顶空瓶中，密封，摇匀，按“2.1.1”色谱条件将系列溶液分别进样测定，记录峰面积，计算校正因子，以甲醇、丙酮溶液浓度（X）为横坐标与相应的校正因子（Y）为纵坐标绘制标准曲线。相关数据见附表1。

2.6 精密度试验 取对照品溶液，依法连续进样6次，记录色谱图。结果甲醇峰面积与内标峰面积之比的相对标准偏差RSD为0.84%；丙酮峰面积与内标峰面积之比的相对标准偏差RSD为1.59%。表明仪器精密度良好。

2.7 检测限与定量限 将对照品溶液逐步稀释，观测各对照物质的峰高，当峰高为基线噪音的3倍左右时为检测限，当峰高为基线噪音的10倍左右时为定量限，结果见附表2。

2.8 加样回收率试验 精密称取牛肺表面提取物质12mg，置顶空进样瓶中，分别加入不同浓度的对照品溶液，迅速加盖密闭，超声1分钟，依法测定，结果见附表3。

2.9 样品检测结果 取样品，按“2.2.1”色谱条件进行测定，甲醇含量0.002%，丙酮含量0.001%。

附表1 线性实验结果（n=10）

附表2 检测限与定量限实验结果

附表3 回收率实验结果

3 讨论

肺表面活性物质是一种主要由磷脂和特异性蛋白质[5]组成的脂蛋白复合物。磷脂含有亲水基团和亲油基团，是生物膜重要组成部分，也是天然乳化剂和表面活性剂，广泛应用于食品、医药、化工等行业[3]。牛肺表面提取物质系自新生小牛肺灌洗液提取制得的磷脂蛋白复合物，该原料制备为注射用牛肺表面活性剂常用于治疗新生儿呼吸窘迫症。其防病机制是肺表面活性物质覆盖在肺泡表面，能降低肺泡表面张力，防止肺泡委陷，维持肺泡毛细血管间液体平衡，防止肺水肿，还能促进肺液清除，保护肺泡上皮细胞等作用[4]。根据国家药品标准提高工作，经查询药监局数据库，牛肺表面提取物质有1个厂家生产。我单位向生产厂家发函收集样品，由于该药品为新生儿急救类药品，生产厂家仅能提供1个批次样品。该产品成分复杂, 含有磷脂、蛋白质、甘油脂、游离脂肪酸等，原方法采用直接进样测定，其易吸附于柱子内，影响残留溶剂的洗脱，对色谱柱也有损坏。参考中国药典2015年版[3]及相关文献，建立了顶空进样法（内标法）测定。内标法可在一定程度上消除操作条件（如进样量、色谱条件）的变化所引起的误差。本方法采用正己烷作为内标，在选定的色谱条件下能与待测成分及干扰成分达到很好的分离。该方法操作简便，灵敏度显著高于现有方法，精密度好，结果准确可靠。

经方法学验证，新建立的方法可为牛肺表面提取物生产过程中使用甲醇、丙酮的控制提供了更加可靠准确的方法，其线性、精密度、回收率实验结果理想，也为牛肺表面提取物及其制剂的标准提高奠定了方法学基础。