郭建平，万佳佳，陆兆新，吕凤霞，张 充，赵海珍，别小妹*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种主要的食源性致病菌[1]，可产生多种肠毒素，引起食物中毒。消毒虽然可以杀灭金黄色葡萄球菌，却并不能完全破坏其分泌的毒素。金黄色葡萄球菌易污染肉、奶及其制品等食品[2-3]，人们如果误食这些污染过的食品，会出现腹泻、呕吐等食物中毒反应，严重者可能会导致死亡。金黄色葡萄球菌引起的食品安全事件[4-6]时有发生，给人们的生命安全带来严重的威胁，对经济生产造成严重的损害，因此做好致病菌的检测显得尤为重要。

GB 4789.10—2016《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》中规定的金黄色葡萄球菌检测方法[7]周期较长，不利于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测，且较长的检测周期会对经济生产活动造成一定的影响。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）分子检测技术的发展[8]使得金黄色葡萄球菌的检测周期大大缩短，但是PCR检测需要昂贵的仪器，所以PCR技术在条件和技术相对落后的地区，仍不能满足基层对金黄色葡萄球菌检测的需求。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是由日本科学家Notomi等[9]率先建立的新型体外扩增DNA技术，得益于它特殊的扩增原理，使其具备耗时短、高特异性、高灵敏度、不依赖精密仪器、便捷准确等显著优势。LAMP反应结果主要是通过凝胶电泳法、沉淀法、显色法等方法进行检测[10]。Tomita等[11]通过将钙黄绿素加入到LAMP反应体系中，建立了一种可以不开盖检测LAMP反应结果的技术。Goto等[12]建立了另外一种可视化LAMP检测方法，通过向LAMP反应体系中添加羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue，HNB）达到可视化检测LAMP反应结果，且添加HNB的LAMP反应体系的反应灵敏度较添加钙黄绿素的LAMP反应体系高出10 倍，主要是由于钙黄绿素对LAMP反应有一定的抑制作用，而HNB对LAMP反应没有抑制作用。

现常用来检测金黄色葡萄球菌的目的基因为耐热核酸酶基因，即nuc基因[13]，但有研究发现其他少数葡萄球菌也具有耐热核酸酶基因[14]，导致检测结果出现假阳性。本研究中利用实验室筛选出的金黄色葡萄球菌特异性靶点基因SAR0395[15]建立一种可视化LAMP检测方法，该可视化LAMP不需要昂贵的设备且操作简单，可以在设备较落后的地区进行金黄色葡萄球菌的快速检测，同时该可视化LAMP可以结合酶标仪进行金黄色葡萄球菌的高通量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

本研究所涉及到菌株包括46 株金黄色葡萄球菌和24 株非金黄色葡萄球菌。其中标准菌株分别购买于中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）、广东省微生物菌种保藏中心（GIMCC）、美国菌种保藏中心（ATCC）、中国医学细菌菌种保藏管理中心（CMCC）（表1），其他菌株为南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏。

表1 实验所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.1.2 培养基与试剂

培养基 北京陆桥技术股份有限公司；Bst2.0 WarmStart™ DNA聚合酶、MgSO4NEB（北京）有限公司；甜菜碱 上海源叶生物科技有限公司；HNB上海麦克林生化科技有限公司；基因组提取试剂盒美国OMEGA Bio-Tek公司；100 bp Marker 广州东盛生物科技有限公司；dNTP Mixture 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

T1300II级生物安全柜 赛默飞世尔科技公司；PTC-100TMPCR扩增仪 美国MJ Research公司；A10干式恒温器 杭州龙扬科学仪器有限公司；PowerPac™HC高电流电泳仪 美国Bio-Rad公司；JS-380c全自动数码凝胶成像分析仪 上海培清科技有限公司；Nanodrop2000核酸浓度测定仪 赛默飞世尔科技公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

以实验室筛选的金黄色葡萄球菌高特异性序列SAR0395为靶基因[15]，通过在线引物设计软件Primer Explorer V5（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）设计LAMP引物，引物序列见表2，引物由金斯瑞生物科技有限公司负责合成。

表2 LAMP反应引物Table 2 LAMP reaction primers

1.3.2 基因组提取方法

革兰氏阳性细菌基因组提取方法：使用商品化的OMEGA基因组提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。

革兰氏阴性细菌基因组提取方法：取2 mL菌液放入1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心2 min，保留沉淀；加入无菌水1 mL吹打混匀，12 000 r/min离心2 min，弃上清液；然后加TE缓冲液（pH 8.0）100 µL混匀，置100 ℃煮沸10 min，冰上冷却10 min，12 000 r/min离心2 min，取上清液为DNA模板，-20 ℃备用。

1.3.3 初始LAMP反应方法

参照一般LAMP反应体系[16]，本研究原始LAMP反应体系如下：外侧引物（F3和B3）各0.2 µmol/L，内侧引物（FIP和BIP）各1.6 µmol/L，dNTPs终浓度1.5 mmol/L，Mg2＋终浓度6.0 mmol/L，1×ThermoPol buffer（20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% TritonX-20，pH 8.8，25 ℃），Bst2.0 WarmStart™ DNA聚合酶终浓度0.32 U/µL，1 µL DNA模板，加水补足20 µL。20 µL灭菌石蜡油进行液封。

反应条件：60 ℃，保温1 h。检测方法：取10 µL反应产物和上样缓冲液混合后，2%凝胶电泳检测。

1.3.4 LAMP反应的建立及优化

以金黄色葡萄球菌GIM1.771的基因组为模板进行LAMP体系的优化。分别设置不同温度、Mg2＋浓度、内引物浓度、酶添加量、dNTPs浓度、甜菜碱浓度[17]进行LAMP反应体系的优化，反应结果通过2%凝胶电泳进行检测，选择最佳的反应体系。

1.3.5 LAMP反应可视化方法的建立

HNB是一种Mg2＋指示剂，可以添加到LAMP体系中作为显色剂，LAMP反应前后颜色由紫色变为天蓝色。按照文献中的LAMP添加体系[18]，本研究中向优化的LAMP体系中添加120 µmol/L HNB。实验设置空白对照和阳性组，观察颜色变化，同时对反应液进行凝胶电泳检测。

1.3.6 不同引物添加体系的分析

不同引物添加体系对LAMP分析速度有很明显的影响，本研究中设置I（B3＋FIP＋BIP）、II（B3＋F3＋FIP＋BIP）、III（B3＋FIP＋BIP＋LF）、IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）、V（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LF）、VI（B3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）6 个不同引物添加体系[19]，分别进行LAMP反应20、30、40、50、60 min，LAMP反应结果通过观察颜色变化判定。通过实验选择出反应时间较短的LAMP引物添加体系。

1.3.7 可视化LAMP的灵敏度测定

实验采用两种方法从不同方面对可视化LAMP的检测灵敏度进行评价，包括基因组梯度稀释法和菌落梯度稀释法。

1.3.7.1 基因组灵敏度测定

测定得到金黄色葡萄球菌基因组质量浓度为103 ng/μL，按照10 倍稀释梯度进行稀释，取不同质量浓度基因组进行可视化LAMP检测，反应时间分别为30 min和60 min，实验结果通过观察颜色变化判断。

1.3.7.2 菌落灵敏度测定

将过夜培养的金黄色葡萄球菌GIM1.771用生理盐水进行10 倍系列稀释。用稀释平板法，测定纯培养物活菌数；同时从每稀释浓度菌液中取1 mL菌液提取基因组，取不同菌落梯度的基因组进行可视化LAMP检测，LAMP反应时间为30 min和60 min，实验结果通过观察颜色变化判断。

1.3.8 可视化LAMP的特异性测定

将46 株金黄色葡萄球菌和24 株非金黄色葡萄球菌接种到新鲜培养基中过夜培养提取基因组，取提取的基因组进行可视化LAMP检测，LAMP反应时间为60 min，实验结果通过观察颜色变化判断。以上实验均设置3 次重复。

2 结果与分析

2.1 LAMP反应的建立与优化

图1 LAMP体系的优化Fig. 1 Optimization of LAMP reaction conditions

根据初始LAMP体系建立金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，对温度、Mg2＋浓度、内引物浓度、酶添加量、dNTPs浓度、甜菜碱浓度进行优化。从图1A可以发现，60、61、62 ℃条件下的梯形条带较其他温度亮，且60、61、62 ℃条件下的梯形条带亮度没有显著性差异，考虑到简易加热装置的加热时间，选择LAMP反应温度为60 ℃。从图1B可以看出，dNTPs浓度为1、1.5、2、2.5 mmol/L时，LAMP反应结果优于dNTPs浓度为0.5 mmol/L时的LAMP反应结果，且它们之间没有显著差异，因此选择LAMP反应的dNTPs浓度为1 mmol/L。从图1C可以看出，酶添加量为0.4 U/μL和0.48 U/μL时，LAMP反应结果较好且它们之间无显著差异，同时从经济的角度出发，选择LAMP反应的酶含量为0.4 U/μL。从图1D可以看出，Mg2＋含量过低或过高都会影响LAMP反应，Mg2＋浓度为1、2、3、4 mmol/L时，LAMP反应结果无显著差异，综合考虑，选择LAMP反应的Mg2＋浓度4 mmol/L。从图1E可以看出，不同内外引物比对LAMP反应结果的影响不显著，综合考虑选择LAMP反应的内外引物比为8∶1。从图1F可以看出，甜菜碱浓度为0 mol/L时，凝胶电泳中条带最亮，添加不同含量甜菜碱以后，电泳条带反而变暗，这一结果与文献中报道的甜菜碱可以提高LAMP反应效率的结果相反，在本研究中添加甜菜碱反而不利于LAMP反应的进行，因此在本研究中不添加甜菜碱。

通过LAMP反应的优化，可以得到最优的LAMP添加体系为：外侧引物（F3和B3）各0.2 µmol/L，内侧引物（FIP和BIP）各1.6 µmol/L，dNTPs终浓度1 mmol/L，Mg2＋终浓度4.0 mmol/L，1×ThermoPol buffer（20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% TritonX-20，pH 8.8，25 ℃），Bst2.0 WarmStart™ DNA聚合酶终浓度0.4 U/µL，1 µL DNA模板，加水补足20 µL。20 µL灭菌石蜡油进行液封。反应条件：60 ℃、保温1 h。

2.2 可视化LAMP检测方法的建立

图2 可视化LAMP显色结果（A）及其凝胶电泳图（B）Fig. 2 Visual color of blank control and positive LAMP reaction (A)and corresponding gel electropherograms (B)

在优化过的LAMP反应体系中添加120 μmol/L的HNB，60 ℃反应1 h，可以观察到LAMP显色图（图2A）的颜色变化，阳性反应管中的液体由紫色变为天蓝色，空白对照反应管中的液体保持为紫色；取空白对照反应液和阳性反应液进行凝胶电泳检测，可以得到电泳图（图2B），阳性反应管出现典型的LAMP梯形条带，空白对照没有出现电泳条带；实验结果说明在LAMP反应体系中添加120 μmol/L的HNB，可以建立一种可视化LAMP；可视化LAMP在60 ℃反应1 h，空白对照的颜色和阳性反应的颜色可以用肉眼清楚辨别。

2.3 不同引物添加体系分析

表3 不同引物组合优化Table 3 Optimization of different primer combinations

通过对不同引物添加体系进行实验，从表3发现LAMP反应20 min后，引物添加体系IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）会发生颜色变化，反应管变为天蓝色；V（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LF）、VI（B3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）的颜色会在LAMP反应30 min后变为天蓝色；I（B3＋FIP＋BIP）、III（B3＋FIP＋BIP＋LF）的颜色会在LAMP反应40 min后变为天蓝色；II（B3＋F3＋FIP＋BIP）的颜色会在LAMP反应60 min后变为天蓝色，空白对照颜色一直为紫色。实验中引物添加体系IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF）会在反应20 min后，发生颜色的变化，是最优的引物添加体系，本研究中选择LAMP反应的引物添加体系为IV（B3＋F3＋FIP＋BIP＋LB＋LF），这一引物添加体系和文献[20]报道一致。

2.4 可视化LAMP的灵敏度

表4 可视化LAMP灵敏度测定结果Table 4 Sensitivity of LAMP

通过平板计数得到原始菌液的菌落数为1.9×109CFU/mL。如表4所示，可视化LAMP反应30 min以后，其基因组灵敏度可以达到1.03 pg/μL，其菌落灵敏度可以达到1.9×104CFU/mL。这一灵敏度和文献中报道的灵敏度有一定差距，所以按照文献[21]，将LAMP反应时间设置为60 min。可视化LAMP反应60 min以后，其基因组灵敏度可以达到0.010 3 fg/μL，其菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL。

2.5 可视化LAMP的特异性

图3 可视化LAMP特异性检测结果Fig. 3 Specificity of LAMP

如图3所示，可视化LAMP反应60 min以后，可以发现46 株金黄色葡萄球菌的反应液颜色变为天蓝色，LAMP反应结果为阳性；24 株非金黄色葡萄球菌反应液颜色未变化仍然为紫色，LAMP反应结果为阴性；通过特异性实验可以证实该可视化LAMP检测方法具有良好的特异性。

3 讨 论

本研究建立了一种针对金黄色葡萄球菌的快速、高灵敏度、高特异性的可视化LAMP检测方法。目前金黄色葡萄球菌分子检测常用目的基因为耐热核酸酶基因（nuc）[22-24]，但现在研究发现其他少数葡萄球菌也具有耐热核酸酶基因[14]，可产生耐热核酸酶，导致检测结果出现假阳性。同样地，LAMP检测技术的研究有很多，但较低的特异性和易交叉污染的特点限制了LAMP的实际应用。为解决以上问题，本研究以金黄色葡萄球菌新型特异性靶基因SAR0395为目标片段，建立了一种特异性高、结果准确且灵敏高的可视化LAMP反应体系。

本研究使用的D N A扩增酶为N E B公司Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶，实验证明使用该酶时，反应体系建立以后立即进行LAMP反应与25 ℃孵育2 h以后进行LAMP反应获得的反应结果是一致[25]。因此，使用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶可以避免在室温条件下建立反应时所产生的非特异性扩增。

研究表明，LAMP反应开盖进行凝胶电泳检测，易造成LAMP反应过程中产生的气溶胶扩散到环境空气中，污染实验环境，造成LAMP反应结果产生大量的假阳性[9,11,26]。这一特点大大影响了LAMP反应的应用，本研究添加20 μL石蜡油于反应液上，可以提高反应体系的密封性，防止样品之间的交叉污染，避免反应结果的假阳性。在LAMP反应体系中添加HNB，建立可肉眼辨别反应结果的可视化LAMP，可以实现不开盖进行LAMP结果的观察，避免开盖检测导致的气溶胶，可以达到避免假阳性的作用。

张涛涛等[27]建立了一种金黄色葡萄球菌LAMP检测方法，其灵敏度可以达到100 fg/μL；宋涛平等[28]建立了一种金黄色葡萄球菌LAMP可视化快速检测方法，其灵敏度可以达到0.001 ng/μL；李晓霞等[29]建立了一种原料乳中金黄色葡萄球菌LAMP检测方法，其灵敏度可以达到67 CFU/mL。本研究中建立的可视化LAMP具有更优的灵敏度，其基因组灵敏度可以达到0.010 3 fg/μL，其菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL。利用该可视化LAMP对46 株金黄色葡萄球菌和24 株非金黄色葡萄球菌进行检测，24 株非金黄色葡萄球菌都未出现阳性反应，证实该可视化LAMP具有很好的特异性和可靠性。

本研究建立一种针对金黄色葡萄球菌的可视化LAMP检测方法，并验证了其特异性与灵敏度。通过添加HNB、石蜡油和Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶等手段可以有效控制假阳性。本研究中建立的可视化LAMP具有快速、直观、高灵敏度、高特异性的特点，该可视化LAMP将会成为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的重要手段，为金黄色葡萄球菌的检测与控制做出重要贡献。