张 玲，石彩文，肖凯军*，李春海，莫军全，张 钟，史煜宇

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641；2.广东石油化工学院生物与食品工程学院，广东 茂名 525000）

罗非鱼是世界水产业科研和养殖生产的重点淡水养殖鱼类。近十年来，我国每年罗非鱼产量以平均4.82%左右的速度递增，稳居世界首位[1]，但加工产品主要是品种单一、水平较低、附加值不高的冻鱼片和冻全鱼等[2]，生产过程中产生的鱼皮、鱼鳞等副产物，约占鱼体总质量的40%～50%，除少部分被加工成鱼粉作为饲料廉价出售，大多未得到充分利用，导致生物资源浪费，也带来一系列环境问题[3]。随着人们对生物分子结构及功能的认识不断深入以及国内加工技术的不断提高，利用鱼皮、鱼鳞提取明胶[4-6]及胶原蛋白多肽的研发[7-8]已成为热点，也形成较大规模的产业。

肽是由氨基酸组成的聚合物，主要来自于蛋白质分解的中间产物。胶原蛋白肽是胶原或明胶经酶解等处理后制得的具有较高消化吸收性、分子质量为1 000～30 000 Da的产物，其不具有明胶的凝胶性能[9]，但具有多种人体代谢和生理调节功能，如抗氧化[10]、抗菌[11-12]、降血压[13]、抗疲劳[14]、抗肿瘤[15]等作用，在功能性食品[16-17]、医学[18-19]、化妆品[20-21]等领域广泛应用，因此测定多肽含量方法非常重要。

目前常见的多肽含量测定方法有双缩脲法[22]、福林-酚试剂法[23]、邻苯二甲醛法[24-25]、紫外吸收法等[26]，但同种方法测定不同类型、不同体系多肽含量的条件不同。双缩脲比色法中最大吸收波长、肽的检测浓度范围、pH值、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）用量对检测方法的适用性、准确度及重复性有显著的影响且需要标准品，实际应用中多选用四肽（Gly-Gly-Tyr-Arg）标准品[27-28]，是非罗非鱼源酶解蛋白肽的同源物，测定结果产生较大偏差，且价格昂贵。标准品或对照品应遵循同质原则，可以消除方法基体效应引入的系统误差[26]。罗非鱼皮胶原蛋白肽与罗非鱼源酶解多肽的成分相近，适宜用作肽含量检测的对照品。

本研究选择罗非鱼皮胶原蛋白肽为对照品，对双缩脲法测定多肽的方法进行改良，建立一套快速、相对准确的罗非鱼源胶原蛋白肽酶解体系肽含量检测方法，满足罗非鱼源胶原蛋白肽生产及产品品质相关检测的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标称分子质量为1、3 kDa和5 kDa的罗非鱼皮胶原蛋白肽，标称分子质量为3 kDa和5 kDa的罗非鱼鳞胶原蛋白肽（其分子质量分布情况见文献[29]）、罗非鱼皮胶原蛋白（冻干品），均由广东百维生物科技有限公司提供。

TCA、酒石酸钾钠、硫酸铜、氢氧化钠等均为国产分析纯。0.1 mol/L NaOH溶液、9～13 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L HCl溶液、6 mol/L HCl溶液用于调整检测体系pH值。

双缩脲试剂的配制：1.5 g硫酸铜和6.0 g酒石酸钾钠溶于500 mL蒸馏水中，搅拌加入300 mL的10% NaOH溶液，用蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 仪器与设备

722N可见分光光度计 上海同田生物技术有限公司；HR-120分析天平 四川中浪科技有限公司；CHYZ-10N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州博远实验分析仪器厂；PHS-25 pH计 上海雷磁仪器厂；80-2型离心机 金坛市大地自动化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 实验流程

第1步：以罗非鱼皮胶原蛋白肽（3 kDa）为标准曲线绘制的对照品，研究肽与双缩脲显色络合物的最大吸收波长，寻找线性拟合良好的肽质量浓度范围，确定肽的理想检测质量浓度范围，确定线性拟合度高的pH值及TCA质量分数。

第2步：以罗非鱼皮胶原蛋白肽（3 kDa）为标准曲线绘制的对照品，在第1步确定的理想条件下绘制标准曲线，并检验方法的精密度和重复性。

第3步：考虑实际检测体系中可能有水解底物以及酶等蛋白质的影响，为明确蛋白质的干扰影响，以罗非鱼胶原蛋白为检验蛋白质，加入检测体系中，检测本法的加样回收率和偏差。

第4步：考虑实际生产中有不同分子质量的罗非鱼皮和鱼鳞肽产品，检测体系中肽的种类与标准曲线对照品（标称分子质量为3 kDa的罗非鱼皮胶原蛋白肽）有差别，为检验本法在不同肽产品检测中的适用性，将标准曲线应用于标称分子质量为1 kDa和5 kDa的罗非鱼皮胶原蛋白肽和标称分子质量为3 kDa和5 kDa的罗非鱼鳞胶原蛋白肽的检测中，通过回收率及偏差检验本法的适用性。

1.3.2 测定方法最适参数的选定

1.3.2.1 络合物最大吸收波长的确定

分别取质量浓度为6 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.2、0.5、4.0、8.0 mL于一组50 mL烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH 13.5（控制体积偏差不大于2.5%），立即在波长470～630 nm范围内进行波段扫描确定最大吸收波长。

1.3.2.2 线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定

分别取质量浓度为6 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH 12.5、13.0、13.5（控制体积偏差≤2.5%），立即于1.3.2.1节中确定的最大吸收波长处测定吸光度。以肽质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并按照肽质量浓度分段进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度，确定溶液中多肽的最佳检测质量浓度范围。

1.3.2.3 最适pH值的确定

以1.3.2.2节实验结果为依据，分别取质量浓度为6 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、3.0、5.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整pH 10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5（控制体积偏差不大于2.5%），立即于最大吸收波长处测定吸光度，找出pH值变化不影响吸光度大小的区域，即为检测最适的pH值范围。

1.3.2.4 TCA溶液最适质量分数确定

分别取7%的罗非鱼皮胶原蛋白溶液（胶原蛋白需先置于50～60 ℃水浴锅中加热溶解）1.0 mL于20 mL的离心管中，分别立即加入10 mL质量分数5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、17% TCA溶液，静置10 min后，3 500 r/min离心15 min。分别取上清液1.0、2.0 mL和4.0 mL于一组50 mL烧杯中，对应加入质量浓度为0.3 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液1.0、2.0 mL和2.0 mL，每个体积比一组共8 份，用对应质量分数的TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整到最适pH值（控制体积偏差不大于2.5%），在最大吸收波长处测定吸光度，找出TCA溶液质量分数变化不影响吸光度大小的区域，即为TCA溶液最适质量分数范围。

1.3.3 最适条件下标准曲线的制作

以1.3.2节实验结果为依据，分别取质量浓度为6 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用1.3.2.4节方法确定的TCA溶液最适质量分数补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，按1.3.2.3节方法确定的最适pH值调整（控制体积偏差不大于2.5%），立即于最大吸收波长处测定吸光度。以多肽质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制最适条件下标准曲线并进行线性回归，以R2值大小判断线性拟合程度。

1.3.4 精密度实验

分别取质量浓度为9 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液2 mL于一组50 mL烧杯中，按1.3.3节方法测定吸光度，再计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），检验该方法的精密度。

1.3.5 重复性实验

分别取质量浓度为9 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液2 mL于一组50 mL烧杯中，按1.3.3节方法测定吸光度，根据线性回归方程计算多肽含量，再计算RSD，检验该方法的重复性。

1.3.6 鱼皮胶原蛋白肽的加样回收率

分别取质量浓度为9 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于一组50 mL的烧杯中，按1.3.3节方法测定吸光度，根据线性回归方程计算多肽含量、回收率及RSD。

1.3.7 罗非鱼皮胶原蛋白肽与鱼皮胶原蛋白的加样回收率

分别取7%的罗非鱼皮胶原蛋白溶液（胶原蛋白需先置于50～60 ℃水浴锅中加热溶解）1.0 mL于20 mL的离心管中，立即加入10 mL 1.3.2.4节确定的最适质量分数的TCA溶液，静置10 min后，3 500 r/min离心15 min。分别取上清液2.0 mL于一组50 mL烧杯中，再分别加入质量浓度为9 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液0、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 mL于烧杯中，按1.3.3节方法测定吸光度，根据线性回归方程计算多肽含量、回收率及RSD。

1.3.8 罗非鱼胶原蛋白肽加样回收率

用标称分子质量为1 kDa和5 kDa的罗非鱼皮胶原蛋白肽和标称分子质量为3 kDa和5 kDa的罗非鱼鳞胶原蛋白肽，按照1.3.6节方法进行加样回收率实验。

1.3.9 罗非鱼胶原蛋白肽与罗非鱼皮胶原蛋白的加样回收率

用标称分子质量为1 kDa和5 kDa的罗非鱼皮胶原蛋白肽和标称分子质量为3、5 kDa的罗非鱼鳞胶原蛋白肽，按照1.3.7节进行加明胶加样回收率实验。

1.4 数据处理

每组实验均重复3 次，取平均值；采用SPSS Statistices 17.0软件对数据进行统计分析；采用Origin 8.5软件进行图片绘制。

2 结果与分析

2.1 络合物最大吸收波长的确定

图1 双缩脲络合物波段扫描曲线Fig. 1 Absorption spectra of biuret complex at different concentrations

从图1可以看出，不同质量浓度的鱼皮胶原蛋白肽在470～630 nm的最大吸收波长均为545 nm，这与文献[22]报道的多肽与双缩脲络合物最大吸收波长一致，因此本实验确定545 nm为检测最适波长。

2.2 多肽线性质量浓度范围的确定

图2 多肽线性拟合曲线Fig. 2 Linear fi tting curves of peptide

表1 多肽质量浓度与吸光度线性关系拟合方程Table1 Linear fi tting curves between polypeptide concentration and absorbance

如图2、表1所示，多肽质量浓度在0.03～0.15 mg/mL与1.8～3.0 mg/mL范围内，不同pH值的线性回归曲线R2均低于0.99，拟合程度相对较低。而在质量浓度为0.3～1.5 mg/mL范围内，不同pH值的曲线都呈线性分布，且R2大于0.99，相关性较好。因此可以确定多肽溶液最佳检测质量浓度范围为0.3～1.5 mg/mL。

2.3 最适pH值的确定

图3 最适pH值曲线Fig. 3 Determination of optimal pH

由图3可知，在pH 10.5～12.0范围内鱼皮胶原蛋白多肽溶液的吸光度随着pH值的增大而不断增大，而在pH 12.5～13.5内呈现出吸光度大小不受pH值变化的影响，即pH 12.5～13.5为检测最适pH值范围，在此范围内多肽含量的检测不受pH值影响，因而从经济效益及操作安全方面考虑，选择最适pH值为12.5。

2.4 最适TCA溶液质量分数的确定

图4 最适TCA溶液质量分数曲线Fig. 4 Determination of optimum TCA concentration

由图4可知，在TCA溶液质量分数为5%～10%范围内吸光度很大且曲线平缓，是因为使用的TCA溶液质量分数不足以沉淀胶原蛋白，TCA溶液质量分数微弱的变化就能很明显地展现在曲线上，因此在TCA溶液质量分数为5%～10%的曲线相对陡峭；TCA溶液质量分数为10%～12%范围内曲线下降趋势逐渐趋于平缓；而TCA溶液质量分数在14%～17%时吸光度也有较明显的下降，这可能是因为TCA过量造成体系pH值过低，促使部分多肽水解成氨基酸。3 条曲线在TCA溶液质量分数13%～14%的范围内吸光度大小均表现出不受TCA溶液质量分数变化的影响。研究TCA用量对不同比例胶原蛋白和肽体系中检测吸光度的影响，目的是找出TCA用量不影响肽含量检测的范围，从实验结果可知，TCA溶液质量分数为13%～14%满足要求，再结合成本考虑，可选择最适TCA溶液质量分数为13%。

2.5 最适条件下标准曲线的绘制

基于单因素试验结果，选择标称分子质量为3 kDa的罗非鱼皮胶原蛋白肽为对照品，在质量浓度0.3～1.5 mg/mL范围内，用蒸馏水配制质量浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL的肽溶液，添加13% TCA溶液，调整体系pH 12.5（控制体积偏差不大于2.5%），在波长545 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。

拟合方程为y=0.144 9x＋0.001 5，R2为0.999，表明该方法中吸光度与样品质量浓度线性关系良好，可应用于双缩脲法测定多肽含量，线性质量浓度范围为0.3～1.5 mg/mL。

2.6 精密度实验结果

表2 鱼皮胶原蛋白肽（3 kDa）精密度实验结果Table 2 Precision for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

取质量浓度为9 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液2 mL共6 份，按照最佳条件加入检测试剂（最终肽溶液被稀释成20 mL，质量浓度为0.9 mg/mL），并测定吸光度。由表2可知，RSD为1.84%，说明本测定方法的精密度较好。

2.7 重复性实验结果

表3 鱼皮胶原蛋白肽（3 kDa）重复性实验结果Table 3 Repeatability for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

取质量浓度为9 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液2 mL共6 份，按照最佳条件加入检测试剂，并测定吸光度，再根据线性回归方程计算多肽的含量，再计算RSD，检验该方法的重复性。由表3可知，测定含量平均值为107.7%，RSD为1.86%，说明本测定方法的重复性良好。

2.8 鱼皮胶原蛋白肽的加样回收率

表4 鱼皮胶原蛋白肽（3 kDa）加样回收率Table 4 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (3 kDa)

用质量浓度为9 mg/mL的3 kDa罗非鱼皮胶原蛋白肽溶液，在最佳检测条件下配制成不同质量浓度的检测体系，检测吸光度，计算肽的实测质量浓度，并计算平均回收率。由表4可知，平均回收率为109.7%，RSD为1.00%。

2.9 鱼皮胶原蛋白肽与胶原蛋白的加样回收率

表5 鱼皮胶原蛋白肽（3 kDa）与鱼皮胶原蛋白的加样回收率Table 5 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (3 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

在检测体系中引入质量分数为7%的罗非鱼皮胶原蛋白溶液，在固定条件下肽的实测质量浓度，与样品真实质量浓度进行比较并计算加样回收率。由表5可知，平均回收率为113.9%，RSD为1.39%。与2.8节的回收率和RSD结果接近，说明此工艺条件测定多肽含量不会导致胶原蛋白水解，此法测定多肽含量的结果准确、可靠。

2.10 罗非鱼胶原蛋白肽及鱼皮胶原蛋白的加样回收率

表6 鱼皮胶原蛋白肽（5 kDa）加样回收率Table 6 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (5 kDa)

表7 鱼皮胶原蛋白肽（5 kDa）与鱼皮胶原蛋白的加样回收率Table 7 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (5 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表8 鱼皮胶原蛋白肽（1 kDa）加样回收率Table 8 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (1 kDa)

表9 鱼皮胶原蛋白肽（1 kDa）与鱼皮胶原蛋白的加样回收率Table 9 Recoveries for fi sh skin collagen peptide (1 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表10 鱼鳞胶原蛋白肽（5 kDa）加样回收率Table 10 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (5 kDa)

表11 鱼鳞胶原蛋白肽（5 kDa）与鱼皮胶原蛋白的加样回收率Table 11 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (5 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

表12 鱼鳞胶原蛋白肽（3 kDa）加样回收率Table 12 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (3 kDa)

表13 鱼鳞胶原蛋白肽（3 kDa）与鱼皮胶原蛋白的加样回收率Table 13 Recoveries for fi sh scale collagen peptide (3 kDa) with the addition of fi sh skin collagen

从表6～13可以看出，改变检测体系中的罗非鱼肽的种类后，加样回收率相差不大，偏差均较小，说明本法适用于罗非鱼源肽含量的检测。

3 结 论

本研究结果表明，双缩脲比色法检测鱼皮胶原蛋白肽的最佳工艺条件为波长545 nm、体系pH 12.5、1 3% T C A溶液，肽测定的线性质量浓度范围为0.3～1.5 mg/mL，得到重复性和精密度实验的RSD分别为1.86%、1.84%，加入胶原蛋白与未加入胶原蛋白的平均回收率分别为113.9%、109.7%，RSD分别为1.39%、1.00%，相差不大；将本法应用于不同种类罗非鱼肽产品体系的检测，加样回收率相差不大，偏差都较小，说明本法适用于罗非鱼源肽含量的检测。

双缩脲法既能测定蛋白质含量也能测定肽含量，其机理主要是双缩脲试剂与蛋白质和肽结构中—CONH—基团在碱性环境中发生双缩脲反应生成显色络合物。本法采用TCA去除体系中存在的酶解底物及酶等蛋白质对肽含量检测的干扰，但加入TCA可能会导致蛋白质的水解，造成检测结果偏高。本研究发现体系pH值对络合物显色情况有重要影响，当pH值在3.5～4.5之间时，体系由无色转变成浅蓝色；在pH 8～9之间才会由浅蓝色变成紫色；在pH 10.0～12.5之间，pH值越高，体系吸光度越大，pH值会影响测定结果；在pH 12.5～13.5之间，pH值不再影响吸光度的测定。调整体系pH值一定要精确、迅速并控制调整后的总体积偏差。体系中多肽含量范围对线性关系也很重要，为提高检测准确度，一定要控制体系多肽质量浓度在0.3～1.5 mg/mL范围内。此外，样品检测体系调整好后应立即测定吸光度，必须在1 min内完成检测，否则体系会产生肉眼能见的色差，造成检测误差。

本研究遵循同质原则，选用罗非鱼皮胶原蛋白肽作为对照品，对经典的双缩脲法测定多肽含量中几个关键影响因素进行了细化研究，找到了理想条件，建立了一套较为精确的检测方法，适应于罗非鱼源胶原蛋白肽含量的快速检测，具有良好的实际应用前景；但对于其他鱼类胶原蛋白肽含量的检测是否适用，则需进一步研究。