夏 季，方 勇，王梦梦，张义祥，杨文建，马 宁，胡秋辉，裴 斐*

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210023）

香菇（Lentinus edodes），又名香覃、冬菇，属于担子菌门，香菇属，是我国特有的一种食用菌，其人工栽培已有800 a的历史[1]。香菇富含多种人体所需的氨基酸、无机盐以及维生素，并且含有香菇多糖、麦角甾醇等多种活性成分[2-3]，具有减少机体氧化损伤、降低血脂含量等多种生物活性功效[4-5]。近些年来，微生物发酵主要以果蔬等为原材料，食用菌发酵产品的报道较少[6]。市面上食用菌发酵产品以传统发酵为主，得到的产品易受温度、pH值、菌种配比等多种因素影响，发酵过程难以控制，质量难以标准化；同时传统发酵生产周期较长且不固定，难以应用于大规模工业生产。有研究发现接种纯种菌种进行发酵可以保证产品质量的稳定性，缩短生产周期，降低成本[7-8]。因此，用纯种发酵来取代自然发酵具有广阔的应用前景。

通过乳酸菌发酵将香菇制成泡菜可以通过微生物的发酵来提高其风味及口感，延长贮藏时间，显著提高附加价值[9-10]。同时，泡菜具有预防心脑血管疾病、抗肥胖、减少细胞的氧化损伤等功效[11-12]。但是，目前发酵泡菜的制作工艺存在诸多问题，主要表现在发酵过程中产品易发生褐变、软化等品质劣变现象，严重影响产品感官品质；发酵泡菜中亚硝酸盐含量较高，其安全性无法保证[13]。因此，如何改进发酵方式、缩短发酵周期并保证发酵产品的安全性及使用品质，已经成为众多学者及泡菜生产企业关注的重点。有学者采用低温漂烫前处理方式研究了其对纯种发酵泡菜质构特性的影响，结果发现低温漂烫处理能够显著降低泡菜的软化，提高产品风味及口感[14]。低温漂烫处理是指通过短时间较低温度的热水处理，增强果胶甲酯酶的活性以及细胞之间的胶黏度，从而增加产品硬度及弹性的方法，其操作简便、成本低、效果显著[15]。同时，传统发酵过程中亚硝酸盐含量增加与微生物尤其是细菌的还原作用相关，有研究报道通过纯种发酵替代传统天然发酵不仅可以显著降低亚硝酸盐含量，并且具有发酵周期短、发酵产品质量稳定等优点[16]。另外，在发酵过程中通过添加一定浓度的多酚、VC、植酸及皂基等生物活性物质也可以减少亚硝酸盐的形成[17-19]。沈菲儿[20]研究了纯种发酵和自然发酵莲藕泡菜的发酵周期及安全性，发现纯种乳酸菌发酵能够缩短生产周期，降低亚硝酸盐含量。Wang Qi等[21]研究了高粱粟酸粥发酵的最适条件，结果发现接种乳酸菌进行发酵能够显著提高发酵产品的感官品质。近年来，对于香菇纯种发酵技术的研究报道较少，因此研究比较不同发酵处理对香菇发酵产品品质、亚硝酸盐控制和风味的影响具有非常重要的意义。

本研究通过筛选低温漂烫时间及控制发酵过程中硝酸盐及亚硝酸盐含量确定发酵条件，详细比较不同发酵处理香菇泡菜产品的发酵周期、pH值、色度、质构特性、游离氨基酸组成及风味特征物质，为建立高品质、低亚硝酸盐、风味特征浓郁的新型香菇发酵泡菜产品工业化生产工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌、肠膜明串珠菌 广东省微生物菌种保藏中心。

新鲜香菇 江苏省天丰有限公司；食盐、白砂糖、花椒、生姜、干辣椒、八角 南京市栖霞区农贸市场；无水氯化钙（食品级） 连云港科德食品配料有限公司；M R S固体培养基、亚硝酸钠标准溶液（100 mg/L）、硝酸钠标准使用液（1 000 mg/L）阿拉丁试剂有限公司；茚三酮缓冲液 日本日立公司。

1.2 仪器与设备

厌氧培养箱 赛默飞世尔科技公司；1200高效液相色谱仪、7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；CM-5色差仪 日本柯尼卡美能达公司；TA. XT.Plus质构仪 英国超技仪器（SMS）公司；玻璃电极pH计 杭州汇尔仪器设备有限公司；匀浆机 北京帅恩科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

将香菇清洗、去根后切成0.5 cm的菇块，置于1% CaCl2溶液中进行低温漂烫处理，漂烫温度及时间分别为50、55、60 ℃及15、20、25 min，随后立即用冷水冲洗降温，待水分沥干后用于发酵实验，不同温度及时间处理组均重复3 次。

1.3.2 香菇泡菜的制备

选用周光燕等[22]方法进行泡菜发酵实验，并在原方法基础上稍作改进。

纯种发酵：低温漂烫后的香菇称质量装坛→泡渍（菜水比1∶1，同时加入质量分数为2%的食盐→加入调味料（质量分数为2%大蒜、生姜及干辣椒；质量分数为6‰的八角茴香）→接种10%的菌种（植物乳杆菌与肠膜明串珠菌的菌种配比为1∶1）→加水密封，25 ℃恒温连续发酵。

自然发酵：鲜香菇→清洗干净→切分称质量→泡渍（菜水比1∶1，同时加入质量分数为2%的食盐和蔗糖→加入调味料（质量分数为2%大蒜、生姜及干辣椒；质量分数为6‰的八角茴香）→加水密封，25 ℃恒温连续发酵。

1.3.3 pH值、亚硝酸盐及硝酸盐的含量测定

在连续发酵的实验过程中，每隔24 h测定一次发酵液中的pH值及泡菜中的硝酸盐及亚硝酸盐含量。其中pH值的测定采用玻璃电极pH计；亚硝酸盐及硝酸盐的测定采用高效液相色谱法。

色谱条件：色谱柱：Eclipse plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol/L KH2PO4-H3PO4溶液，体积分数5%乙腈溶液；流速1.0 mL/min，波长212 nm，柱温25 ℃，进样体积20 μL。

将取出的泡菜样品用去离子水浸泡10 min，沥干后进行匀浆。取10 g匀浆超声提取30 min，8 000 r/min离心15 min，取上清液经0.22 μm过滤器过滤后，上机进样自动分析，并通过外标法对样品中亚硝酸盐和硝酸盐进行定量。

1.3.4 色度及质构的测定

采用色差仪测定泡菜样品的色度值，每组样品平行测定6 次，最后取其平均值。

将发酵后的泡菜样品沥干后用TA. XT. Plus物性测定仪测定其硬度、聚黏性、弹性及咀嚼性。测定参数为：采用P/6探头，TPA模式，探头预备速率5.00 mm/s；测定速率1.00 mm/s；探头测后速率1.00 mm/s；测定高度6.00 mm；最小感知力0.005 kg；每组样品平行测定6 次，最后取其平均值。

1.3.5 发酵泡菜产品中游离氨基酸的测定

发酵泡菜产品中游离氨基酸的种类及含量采用氨基酸自动分析仪进行测定。

样品前处理：取冻干后的发酵泡菜样品0.2 g于10 mL水解管中，加入6 mol/L HCl溶液后密封，在烘箱中110 ℃反应24 h。样品过滤后用6 mol/L HCl溶液定容至50 mL，取3 mL旋蒸至干，加入30 mL 0.02 mol/L HCl溶液溶解，过0.22 μm滤膜后上机分析。

氨基酸自动分析仪上机条件：分离柱（4.6 mm×60 mm，2.7 μm）温度57 ℃，阳离子交换树脂；检测波长570 nm（脯氨酸为440 nm）；流动相：锂柱体系缓冲盐体系，茚三酮缓冲液；进样量20 μL；使用自带软件进行数据分析。

式中：C1为样品中游离氨基酸的质量/ng。

1.3.6 发酵泡菜产品挥发性成分测定

采用气相色谱-质谱联用方法进行测定。

顶空固相微萃取条件：参考Nie等[23]的方法，称取5.0 g匀浆泡菜样品于20 mL顶空瓶并放置在60 ℃恒温水浴锅内，萃取头在250 ℃活化30 min后，插入顶空瓶内吸附40 min，随后将萃取头插至进样口，解离挥发性物质成分5 min，每次解吸后萃取头需重新老化30 min。

气相色谱条件：色谱柱：DB-5 MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min速率升至150 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min速率升至230 ℃，保持2 min；载气为氦气，流速为0.8 mL/min，不分流进样。

质谱条件：电离方式为电子电离，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，能量70 eV；质量扫描范围m/z25～450。

1.4 统计分析

色泽及质构实验重复6 次，其他实验均重复3 次。实验数据采用软件SAS（version V8）进行统计分析，结果以表示；多重数据采用SPSS（version 17.0）Duncan新复极差法检验数据的差异性，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 低温漂烫最适条件的筛选

表1 不同低温漂烫方式对发酵泡菜pH值、色度及质构特性的影响Table 1 Effects of low-temperature blanching on pH, L value and texture of Lentinus edodes kimchi

如表1所示，在纯种发酵组和自然发酵组中，不同低温漂烫处理发酵液的pH值无明显差异（P＞0.05）；随着漂烫温度的升高，发酵产品的色度和硬度先增加后降低，且都与对照组差异显著（P＜0.05）；随着漂烫时间的延长，发酵产品的色度呈先增加后降低的趋势，且显著高于对照组（P＜0.05）。同时，纯种发酵香菇泡菜产品的色度、硬度、弹性及咀嚼性均显著高于对应的自然发酵处理组（P＜0.05），这表明纯种发酵乳酸菌能够抑制其他有害微生物的活动，减少其果胶水解酶类的分泌，增加泡菜的硬度。在纯种发酵组中，B2、C2、C3组发酵产物色度值较大，褐变程度较少；硬度及弹性高，且B2组聚黏性显著低于其他处理组（P＜0.05）。

为达到钝化酶活、减少产品软化的目的，漂烫的温度不宜过高，高温会使果蔬等原料的果胶甲酯酶失活，同时抑制其与钙、镁等离子的交联作用，从而降低产品硬度及弹性。Lee等[24]研究了26 个品种胡萝卜在55、66、77、88 ℃及100 ℃漂烫时的硬度、游离果胶甲基酯酶含量及pH值，结果表明不同处理组样品硬度在高温处理时会下降，且果胶甲基酯酶在高温下会失去活性。高芙蓉等[25]在研究低温漂烫对甜瓜品质的影响时，发现当温度高于65 ℃时，甜瓜硬度降低，贮藏期减少。因此，在实验过程中选取了50、55 ℃及60 ℃三个温度梯度进行实验。通过综合比较发酵终产物的色度及质构特性，在保证色度的前提下，选取了硬度及弹性最高的处理组，并确定了低温漂烫工艺的最佳条件：55 ℃水浴处理20 min。在后续的实验中，以此工艺作为发酵前处理条件。

2.2 香菇泡菜发酵过程中亚硝酸盐的控制

图1 自然发酵和纯种发酵过程中亚硝酸盐（a）和硝酸盐（b）含量的变化Fig. 1 Changes in contents of nitrite (a) and nitrate (b) during natural fermentation and pure culture fermentation

如图1a所示，鲜香菇中亚硝酸盐含量在发酵过程中呈先上升后下降的趋势，与果蔬等发酵过程中亚硝酸盐含量的变化规律一致[26]，香菇在发酵第2天出现短暂的亚硝酸峰，随后逐渐消失。与自然发酵相比，纯种发酵处理组产生的亚硝酸峰值含量（16.86 mg/kg）低于自然发酵的峰值（19.32 mg/kg），且发酵8 d后含量最低为4.75 mg/kg，显著低于国家限量卫生标准（20 mg/kg）。同时在泡菜发酵时分别加入0.5‰ VC和0.5‰茶多酚，其泡菜发酵终产物亚硝酸盐含量分别为3.11 mg/kg和4.07 mg/kg，其中加入VC的处理组与对照组相比具有显著差异（P＜0.05）。如图1b所示，在自然发酵和纯种发酵组，硝酸盐含量在第2天降低显著，此现象与亚硝酸盐在第2天产生亚硝酸峰的规律相符。在所有的发酵处理组中，最终发酵产品硝酸盐含量都在28～32 mg/kg，远低于国家规定的不宜生食的最高限量标准（785 mg/kg）。进行泡菜发酵时，初期在革兰氏阴性菌及肠道细菌等微生物的作用下，将本身的硝酸盐转化为亚硝酸盐，使亚硝酸含量升高；随着发酵时间的延续，发酵液的pH值逐渐降低，同时酸性环境有助于亚硝酸盐的降解，产生的亚硝酸盐又很快消失[27]。纯种发酵相比于自然发酵，其亚硝酸盐峰值较低，可能是由于接种的乳酸菌能够在发酵初期使环境pH值显著降低，而酸性环境能够促进亚硝酸盐转化降解为硝酸盐；同时乳酸菌的生命活动能够抑制其他微生物的代谢活动及亚硝酸盐还原酶类的合成。与对照组相比，在发酵初期加入VC和茶多酚后，发酵泡菜产品中亚硝酸盐含量显著低于其他处理组（P＜0.05）；有研究表明VC及酚类等活性物质可以通过抑制微生物产生还原硝酸盐的相关酶类降低发酵泡菜中亚硝酸盐的形成[28-29]。

2.3 发酵方式对香菇泡菜发酵过程中pH值的影响

图2 自然发酵和纯种发酵过程中pH值的变化Fig. 2 Changes in pH during natural fermentation and pure culture fermentation

如图2所示，纯种发酵和自然发酵组pH值都随着时间的延长逐渐降低。纯种发酵泡菜在第7天pH值达到3.55，并在随后的时间内保持在3.5～3.55的范围内，而自然发酵组在第11天pH值达到3.54，随后保持稳定。一般认为当环境pH值稳定时发酵结束，这时环境中微生物的生长旺盛，代谢产物最多，泡菜的风味、口感最佳，发酵时间继续延长会导致泡菜发酸，微生物有毒代谢产物增加，影响泡菜品质[21]。在发酵初期，纯种发酵香菇泡菜的pH值下降速率较快，这是由于纯种发酵泡菜中乳酸菌大量生长繁殖、代谢旺盛，产酸增加使环境pH值迅速下降；而自然发酵泡菜中存在大量不同种类的微生物，在厌氧环境中乳酸菌的产酸量及产酸速率都较低，需要较长的时间进行繁殖代谢才能形成优势菌种，进而完成产品发酵。与自然发酵相比，纯种发酵完成时间由11 d缩短至7 d，这与有学者研究发现在泡菜的制作过程中，接种乳酸菌进行纯种发酵能够缩短发酵时间，提高发酵速率的结果相一致[30]。

2.4 香菇泡菜中游离氨基酸的成分及含量分析

表2 自然发酵和纯种发酵过程中游离氨基酸的组成与含量Table 2 Kinds and contents of free amino acid in naturally fermented and pure culture fermented kimchimg/g

如表2所示，纯种发酵产品游离氨基酸总量为9.82 mg/g，自然发酵产品游离氨基酸总量为6.56 mg/g，纯种发酵和自然发酵产品必需氨基酸（苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、赖氨酸）总量分别为3.68 mg/kg和2.45 mg/kg，呈味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸）的含量分别为3.25 mg/kg和1.80 mg/kg。纯种发酵过程中游离氨基酸总量、必需氨基酸与呈味氨基酸含量均显著高于自然发酵产品。作为评价食品新鲜度和风味的一项重要指标，游离氨基酸含量的多少直接影响发酵产品的口感和风味[31]。纯种发酵中接种的乳酸菌作为优势菌种，其生长活跃、代谢旺盛，能够对发酵产品中蛋白质的降解起到促进作用，同时由于迅速产酸形成有利于发酵的环境，抑制了产品中腐败菌的生长繁殖，有效地阻止了杂菌利用氨基酸等营养物质进行生长，从而提高了游离氨基酸的含量。

2.5 发酵方式对香菇泡菜中挥发性风味成分及含量的影响

表3 纯种发酵和自然发酵中风味物质的组成与含量占比Table 3 Kinds and contents of flavor substances in pure cultured fermented and naturally fermented kimchi

如表3所示，发酵泡菜中检测出主要香气物质包括醚类、酮类、醇类、酸类、酯类、醛类、含硫化合物及烷烃类化合物7 种。纯种发酵和自然发酵泡菜中分别检测出主要香气物质28 种和30 种，在这两种发酵处理中，对烯丙基茴香醚、4-烯丙基苯甲醚的相对含量最高，分别为57.46%、7.11%和56.71%、5.54%；这2种醚类是添加的花椒、八角等辅料的主要挥发性香气成分，对于香菇泡菜风味的形成与丰富有很大的贡献。自然发酵组挥发性成分相对含量较高的是酯类和醇类，其相对含量分别为14.72%和10.86%，主要是由于自然发酵过程中各种不同类型微生物尤其是酵母菌代谢旺盛，大量醇类累积，同时环境中的代谢产物催化了酸与醇的酯化反应及醇与酯的交酯反应使酯类的种类及含量增加。纯种发酵组挥发性成分相对含量较高的是酸类、醛类、酮类、含硫化合物及烷烃类化合物，其相对含量分别为3.93%、1.40%、6.65%、1.31%和13.81%。此结果与陈大鹏等[8]研究娃娃菜纯种发酵及自然发酵过程中香气成分及含量的变化，发现2 种发酵过程中醇类和酯类是主要风味物质，且纯种发酵过程中醛类和酮类相对含量较高的结果相一致。接种乳酸菌的代谢旺盛，能够通过乳酸发酵途径大量产酸，同时由于其旺盛的生命活动，抑制了其他类型微生物的生长繁殖及代谢，产生的中间产物如酮类及醛类较多[32-33]。泡菜的风味形成是多种挥发性香气共同作用的结果，而酮类、醛类、含硫化合物、烯烃类化合物都具有独特的气味[34]，对于香菇泡菜产品风味的形成有一定的贡献，纯种发酵处理组香气物质的种类较多且相对含量较高，表明纯种发酵的香菇泡菜产品风味要优于自然发酵组。

3 结 论

本实验探究了低温漂烫前处理对发酵香菇泡菜色度和质构的影响、泡菜发酵过程中亚硝酸盐的含量控制及不同发酵方式对发酵香菇泡菜挥发性风味成分的影响。与传统发酵方式相比，通过55 ℃、20 min低温漂烫并加入0.05‰ VC，接种肠膜明串珠菌及植物乳杆菌（菌种配比1∶1）纯种发酵能够显著提高发酵香菇泡菜的色度和硬度，降低泡菜中亚硝酸盐的含量，缩短发酵周期，增加发酵产品游离氨基酸种类和含量，且经纯种发酵后香菇泡菜产品的香气种类及相对含量更为丰富。通过研究对比不同发酵处理对泡菜产品质构、风味的影响，为香菇发酵泡菜的产业化、标准化及规模化的生产提供理论依据。