蒋华，卜强，吴爱斌，曾明辉，秦锁炳，夏东东

0 引言

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，中国膀胱癌的发病率虽然低于欧美国家，但是呈逐年增长的趋势[1]。目前膀胱癌的治疗以手术切除为主，辅以化疗和免疫治疗等措施，但膀胱癌治疗后易复发，有报道复发率高达80%，其中大约16%～25%复发的肿瘤其恶性程度增加，有10%发展为浸润性或转移性癌，预后较差[2]。膀胱癌的发病率呈现明显性别差异，男性发病率是女性的3倍以上[3]。研究发现，性激素可能与这种性别差异有关，雄激素介导的信号通路可能参与了膀胱癌的发生、发展，然而具体的作用机制还不清楚[4]。

雄激素受体（androgen receptor,AR）作为雄激素发挥作用的重要靶点，一直受到人们的关注。在没有激素作用下，AR存在于胞质中；而在与雄激素结合后，AR构象发生转变，被激活后转移到细胞核内，进而促进靶基因的转录翻译[5-6]。有研究表明，在大多数膀胱癌患者中AR表达增高，而且相比于AR阴性患者，AR阳性患者有更高的复发率、转移率，这说明AR可能作为膀胱癌的预后因素[7-8]。Izumi等[9]研究表明雄激素剥夺治疗可以显著降低膀胱癌复发的风险，但是对于AR信号调节膀胱癌发生、发展的作用机制现在还不清楚。

色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）是一种重要的内源性血管形成抑制因子，对肿瘤有抑制作用[10]。研究表明，PEDF可在正常组织中表达，抑制内源性血管形成，而在多种肿瘤组织中PEDF表达下调，导致肿瘤组织中血管生成增加，促进了肿瘤发生发展[11-12]。研究表明在前列腺癌中PEDF表达受到雄激素的抑制[13]，这说明AR可能会调控PEDF表达。

本文通过研究膀胱癌中PEDF与AR的表达变化及其之间的调控关系，为阐明性激素和膀胱癌的关系提供依据，同时也为膀胱癌的预防和治疗开辟新的途径。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2016年2月—2018年12月江苏省丹阳市人民医院膀胱癌手术取得的石蜡包埋标本30例，病理证实均为膀胱尿路上皮癌。患者年龄51～78岁，平均年龄65岁。其中男19例，女11例。Ta～T1：12例，T2～T3：18例。病例纳入标准：依据WHO肿瘤分类诊断明确，且病历及随访资料完整者。排除标准：无明确病理诊断及病历及随访资料不完全者。所有入选者事前均告知并签署知情同意书，研究方案获得江苏省丹阳市人民医院伦理委员会的批准（批准号:20160841）。

1.2 材料及主要试剂

人膀胱癌细胞TCCSUP购自中国科学院细胞库，RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，PEDF抗体、AR抗体和GAPDH抗体均购自英国Abcam公司，免疫组织化学试剂盒购自南京建成公司，反转录酶购自美国Promega公司，LipofectamineTM2000和定量PCR试剂盒购自美国ThermoFisher公司，雄激素二氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）购自美国Sigma公司，AR干扰慢病毒载体（Lv-AR shRNA）和对照载体（Lv-NC) 购自美国Santa Cruz公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 人膀胱癌细胞TCCSUP培养于含10%胎牛血清（FBS）和1%双抗（青-链霉素）的MEM-EBSS培养液中，并置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养24 h。然后用不同浓度的DHT（0、1、10、100 nmol/L）处理细胞，参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书对细胞进行转染：空白对照组：不做任何转染（Control）、阴性对照组：转染Lv-NC慢病毒载体（Lv-NC），转染组：转染Lv-AR shRNA慢病毒载体（AR shRNA）。

1.3.2 免疫组织化学和评分 免疫组织化学染色严格按照试剂盒操作说明进行，PEDF抗体稀释比例为1:100，AR抗体稀释比例为1:50。染色结果由2位经验丰富的病理医师进行双盲阅片。PEDF阳性表达为细胞质呈现棕黄色颗粒，AR阳性表达为细胞核呈现棕黄色颗粒；采用半定量结果判断，分别对镜下阳性细胞的百分比和染色强度给予评分。阳性着色细胞数：每张切片上观察5个高倍视野（×200），计数阳性细胞百分比，阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%～100%为4分。阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者计分相乘即为最终评分。

1.3.3 Real-time PCR检测PEDF和AR的mRNA表达 收集转染后48 h的细胞，利用TRIzol试剂从不同实验组细胞系中提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书将RNA（1 μg）反转录成cDNA。根据NCBI数据库设计基因PEDF和AR的定量引物，引物序列见表1。以GAPDH基因作为内参，利用SYBR Green实时定量PCR染料法对相关基因的表达进行分析。按照2-ΔΔCT法计算和分析各基因的表达水平。反应体积为25 μl，反应条件：94℃ 2 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，40个循环；72℃ 5 min延伸。每个样品取样3次，每次设置3个重复。实验重复3次。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.3.4 Western blot法检测PEDF和AR的表达水平 RIPA蛋白裂解液（含1×蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）冰上裂解细胞10 min，然后12 000 r/min、4℃离心10 min，将上清液转移至新的EP管中，用BCA法检测蛋白浓度，加入等体积的上样缓冲液，100℃煮沸10 min，取等量蛋白（40 µg）上样，SDS-PAGE进行蛋白电泳。待蛋白完全分离后，将蛋白转移至PVDF膜，将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的TBST（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl和0.1% Tween 20）中室温封闭1 h，然后在封闭液稀释的PEDF和AR一抗（1:1 000）、GAPDH一抗（1:5 000）中4℃孵育过夜，之后用TBST清洗10 min×3次，在封闭液稀释的二抗（1:5 000）中室温孵育1 h，TBST清洗15 min×3次后与ECL反应1 min，用Bio-Rad公司的ChemiDocTMXRX+成像系统获取图像。实验重复3次。

1.3.5 慢病毒转染 将（3～5）×104个/毫升细胞种在12孔板，加入1 ml培养液，培养24 h，病毒感染时50%汇合。然后弃去12孔板中的培养基，每孔加入1 ml凝聚胺溶液（5 μg/ml），每孔加入20 μl病毒液（目的病毒及GFP对照病毒各5孔）；孵育过夜；弃去含病毒的培养基，加入1 ml常规培养液，利用Olympus荧光显微镜检测荧光表达来评价转染效率。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS19.0统计软件进行处理。两样本相关性分析采用Pearson相关分析，两组间数据比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织中PEDF和AR表达呈负相关

利用免疫组织化学检测膀胱癌组织中PEDF和AR的表达，见图1，统计30例膀胱癌组织PEDF和AR表达评分，Pearson相关性分析表明膀胱癌组织中PEDF表达与AR表达呈负相关（r=-0.6569;P=0.003），见图2。

图1 免疫组织化学检测膀胱癌组织中PEDF和AR的表达(比例尺：50 µm)Figure 1 Expression of PEDF and AR in bladder cancer tissues detected by immunohistochemistry (scale:50 µm)

图2 膀胱癌组织中PEDF和AR表达的相关性Figure 2 Correlation between PEDF and AR expression in bladder cancer tissues

2.2 DHT处理对人膀胱癌细胞中PEDF表达的影响

不同浓度的DHT处理人膀胱癌细胞TCCSUP，Real-time PCR结果显示AR mRNA表达水平随着DHT处理浓度的增加而增加，见图3A，同时Western blot结果也显示AR蛋白水平与基因表达水平变化趋势一致，随着DHT处理浓度的增加，AR蛋白水平也增加，见图3B。上述结果表明DTH处理细胞后可上调AR的表达。同时，Real-time PCR结果显示PEDF mRNA表达水平随着DHT处理浓度的增加而减少，见图3C，Western blot结果表明随着DHT处理浓度增加，PEDF蛋白水平减少，见图3D，这表明DTH处理细胞后下调了PEDF的表达。同时相关性分析表明经过DTH处理后的膀胱癌TCCSUP细胞中PEDF和AR表达水平也呈负相关（r=-0.958,P=0.042）。

2.3 建立稳定沉默AR的膀胱癌细胞株

Real-time PCR结果显示：与Control组相比，转染组（AR shRNA）中AR mRNA表达量下降了63.1%，见图4A；Western blot结果显示，与Control组相比，转染组（AR shRNA）中AR蛋白水平下降了81.5%，见图4B。以上结果表明，AR沉默的膀胱癌细胞株构建成功，可用于下一步实验研究。

2.4 沉默人膀胱癌细胞中AR表达可以上调PEDF表达

结果发现：转染组（AR shRNA）中PEDF mRNA表达量是Control组的2倍，见图5A，Western blot结果表明转染组（AR shRNA）中PEDF蛋白水平是Control组的2.4倍，见图5B。以上结果表明膀胱癌细胞系中PEDF表达受到AR信号的抑制。

3 讨论

膀胱癌发病率呈现明显性别差异，男性发病率显著高于女性[2]。雄激素参与了膀胱癌的发生、发展，有研究报道雄激素可能是男性膀胱癌发病率高于女性的原因[4]，但是对于雄激素如何调控膀胱癌的发生发展还需要进一步研究，清楚阐述调控机制，将为膀胱癌的预防和治疗开辟新的途径。

图3 不同浓度DHT处理后AR和PEDF的表达情况Figure 3 Expression of AR(A,B) and PEDF(C,D) after different concentration of DHT treatment detected by Real-time PCR and Western blot

图4 转染AR shRNA后膀胱癌细胞株中AR的表达情况Figure 4 AR expression in TCCSUP cells transfected with AR shRNA detected by Real-time PCR(A) and Western blot (B)

图5 沉默AR后对PEDF表达的影响Figure 5 PEDF expression after AR shRNA treatment detected by Real-time PCR(A) and Western blot(B)

PEDF作为丝氨酸蛋白酶抑制因子超基因家族serpin成员，属于分泌型糖蛋白，具有高度保守的序列，相对分子质量为50 kDa，是一种重要的内源性血管形成抑制因子[14]，在胰腺癌[13]、前列腺癌[15]等的研究中表明过表达PEDF可以抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤生长。这些结果显示其在抗肿瘤方面有十分重要的作用。Ek等[16]研究也发现PEDF可以减少骨肉瘤细胞UMR 106-01和SAOS-2的侵袭，抑制骨肉瘤的肺转移，抑制肿瘤发展。尽管PEDF在多种肿瘤中的作用已被揭示，但是PEDF与膀胱癌的关系鲜有报道。Doll等[17]在前列腺癌中的研究表明雄激素可以抑制PEDF的表达，而雄激素剥夺则恢复了PEDF的水平，抑制肿瘤生长和转移，因此PEDF表达可能受到雄激素的影响。为了分析PEDF表达与AR表达之间关系，我们利用免疫组织化学检测膀胱癌组织中PEDF和AR的表达，统计30例膀胱癌组织PEDF和AR表达评分，结果表明膀胱癌组织中PEDF表达与AR表达呈负相关。

有诸多研究表明，雄激素阻断可以降低AR水平，减少化学药物诱导的膀胱癌发生，并且抑制肿瘤细胞生长和转移[18-20]，同时Izumi等[9]的研究也表明雄激素剥夺治疗可以显著降低膀胱癌复发，提高膀胱癌患者的生存期。但是雄激素是否影响PEDF参与膀胱癌发生发展过程，还不清楚。为了研究雄激素与PEDF之间关系，本实验用不同浓度的DHT处理人膀胱癌细胞TCCSUP后，发现随DHT处理浓度增加，AR表达增加，PEDF表达减少，相关性分析表明PEDF和AR的表达水平呈负相关，结果表明DHT处理人膀胱癌细胞后会显著上调AR表达，下调PEDF表达。进一步利用慢病毒介导干扰AR表达，结果发现PEDF表达水平上调，这表明膀胱癌中PEDF表达可能受到AR信号的抑制。但是在膀胱癌中AR信号如何调控PEDF表达还需要进一步研究。

总之，本文通过研究PEDF与AR的表达变化及其关系，为阐明性激素和膀胱癌的关系提供依据，改善患者的治疗方案，同时也为膀胱肿瘤的预防和治疗开辟新途径。