熊瑛 陈婷 柴宝 曾飞鹏 孙文文 吴波

(1.深圳市妇幼保健院皮肤科，深圳 518000；2.深圳市南山区人民医院皮肤科，深圳 518000)

甲真菌病是甲病中最常见的疾病之一，红色毛癣菌是其主要病原菌[1]。甲真菌病的发病率高，具有可传染性、治疗周期长和复发率高的特点，目前已经成为危害公共卫生的重大问题。甲真菌病传统的治疗以局部外用和系统口服为主，局部治疗只适合浅表感染，系统治疗存在一定不良反应，而且与其他药物有相互作用，不适用于合并较多基础疾病或者活动肝炎患者。

近年来，临床研究表明，多种激光可能对甲真菌病有较好的疗效。Q开关Nd: YAG 1064/532nm激光在临床上可显著改善甲真菌病的症状[2-3]，长脉冲Nd：YAG 1064nm激光治疗远端侧位甲下型的甲真菌病效果也较满意[4]，强脉冲光在体外也能抑制红色毛癣菌的生长和致病性[5]。目前理论认为激光是通过选择性光热解原理，对真菌的光热作用诱导杀真菌活性[6]，但具体哪种激光效果最佳，或者在什么参数设置能最大程度抑制真菌？真菌在激光照射后，通过光热作用发生了什么样的改变，目前也尚未明确。据此，本研究拟比较市面上常用的激光类型，并在不同的能量下对红色毛癣菌生长的影响，以及探讨可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

角蛋白酶降解底物采用Keratin-Azure(美国 Sigma 公司)；实验所用临床分离的红色毛癣菌标准株由中国医学科学院皮肤病研究所惠赠，菌株号为CMCC(F)T1a。分光光度计购于Thermo Scientific公司。

1.2 方法

菌落的制备 制备菌悬液受试菌株于沙堡培养基上培养2周后，将孢子和菌丝洗落于生理盐水中，经过漩涡震荡器震荡，用无菌纱布过滤去除大的菌丝团块及杂质，用比浊管调整菌悬液浓度至2×106CFU/mL备用。将制好的孢子悬液，用移液器取 20 μL分别接种于沙氏琼脂培养基中央，28℃培养 9 d后备用。

实验分组及激光照射 4种激光(不同激光设备参数见表1)，每种分别设低能量、中能量、高能量、未照光组(对照组)，对上述培养皿上的菌落进行垂直照射，照光时激光头距离平皿约 5 cm。激光束照射整个菌落，以螺旋状移动，从周围直至中心。每个菌落照射 25 ～ 30 个光斑，每个菌落表面全部照射约 1 min 后，暂停 2 min，如此反复照射 3次。

测定菌落直径 激光照射结束后，继续放回30℃恒温培养箱中。在激光照射前(第0天)、照射后第1天、第3天、第7天用电子游标卡尺测量并记录菌落直径大小(可精确至0.00 mm)，比较激光照射前后不同能量组菌落直径的变化差异，每个能量组设有3个重复。

处理诱导底物 收集健康成年人的正常甲，将其剪碎后,用无菌生理盐水清洗2 次,75%乙醇清洗1 次，再用无菌蒸馏水清洗2 次。清洗后的甲磨成粉末状，再用紫外线照射灭菌30 min 备用。

制备角蛋白酶粗提液 在盛有20 mL 液体培养基(MgSO40.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，200 mg/L 氯霉素，pH 7.5，120 ℃高压灭菌15 min)的5 个三角烧瓶(容积50 mL)中，利用微量移液管分别移入1mL的2×106CFU/mL菌悬液，再分别加入甲粉末0.1 g，另外1个不加任何底物作为空白对照组。所有三角烧瓶于27 ℃下震荡培养(130×g)18～21 d后，分别将混悬液倒入50 mL 的离心管中，4390×g 离心10 min，提取10 mL 上清液。

测定角蛋白酶活性 取激光照射的第7d菌悬液测角蛋白酶活性。在5个离心管(容积10 mL)中分别加入2 mL 缓冲液(10 mg keratin-azure、200 mmol/L Tris-HCL、100 mmol/L CaCl2，调整pH 至8.0)，再分别加入各角蛋白酶粗提液3 mL，37℃水浴培养72 h，然后9000×g 离心5 min，取上清液。将上述上清液用分光光度计测定595 nm 处的A值，以不含角蛋白酶粗提液，含等量Keratin-Azure的CaCl2缓冲液作为阴性对照组。595 nm 处A 值较阴性对照组每改变0.01相当于1 U角蛋白酶活性。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS13.0统计软件包处理，数据用几何均数±标准差(G±s)表示，应用方差分析和t检验对数据进行分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同激光不同能量对红色毛癣菌角蛋白酶活性的影响

实验所用最低能量组的不同激光对红色毛癣菌产生角蛋白酶的活性均无明显抑制作用(与未照射组比较，P>0.05)。2～4J/cm2(中～高能量)Q开关Nd: YAG 532nm激光、4～8J/cm2(中～高能量)Q开关Nd: YAG 1064nm激光、4J/cm2(高能量)的长脉宽Nd: YAG 1064nm激光能明显抑制红色毛癣菌的角蛋白酶活性(与未照射组比较，P<0.05)。而不同能量(10～40 J/cm2)脉冲强光组与未照射组的红色毛癣菌的角蛋白酶活性比较，差异均无统计学意义，P>0.05(见表2)。高能量密度照射时，不同激光对红色毛癣菌产生角蛋白酶活性的抑制作用由高到低分别为Q开关Nd: YAG 1064nm激光、Q开关Nd: YAG 532nm激光、长脉宽Nd: YAG 1064nm激光和脉冲强光。

2.2 不同激光不同能量对红色毛癣菌菌落直径的影响

Q开关Nd: YAG 532nm激光在不同能量时对红色毛癣菌菌落直径的影响 红色毛癣菌在接受不同能量激光照射后第1天、第3天、第7天的菌落直径比较显示，当Q开关Nd: YAG 532nm激光能量达到2～4J/cm2(中～高能量)时，红色毛癣菌的菌落直径明显小于阴性对照组，有统计学差异，表明此能量激光对菌落的生长产生了抑制作用。而Q开关Nd: YAG 532nm激光能量为1J/cm2(低能量)时，对红色毛癣菌菌落的生长无明显抑制作用。见图1。

Q开关Nd: YAG 1064nm激光在不同能量时对红色毛癣菌菌落直径的影响 红色毛癣菌在接受不同能量Q开关Nd: YAG 1064nm激光照射后第1天、第3天、第7天的菌落直径比较显示，当Q开关Nd: YAG 1064nm激光能量达到4 ～8J/cm2(中～高能量)时，红色毛癣菌的菌落直径明显小于阴性对照组，表明此能量对菌落的生长产生了抑制作用。而Q开关Nd: YAG 1064nm激光能量为2J/cm2(低能量)，对红色毛癣菌菌落的生长无明显抑制作用。见图2。

长脉宽Nd: YAG 1064nm激光在不同能量时对红色毛癣菌菌落直径的影响 不同能量的长脉宽Nd: YAG 1064nm激光照射红色毛癣菌之后第1天、第3天、第7天的菌落直径比较显示，长脉宽Nd: YAG 1064nm激光激光能量达到4J/cm2(高能量)，红色毛癣菌的菌落直径小于阴性对照组，表明此能量对菌落的生长产生了抑制作用。而能量为2J/cm2(中能量)时，对红色毛癣菌菌落的生长无明显抑制作用。见图3。

585nm脉冲强光在不同能量时对红色毛癣菌菌落直径的影响 不同能量的波长585nm脉冲强光照射红色毛癣菌之后第1天、第3天、第7天的菌落直径与阴性对照组比较无明显统计学差异，显示本文所用的能量密度585nm脉冲强光对菌落的生长无明显抑制作用。见图4。

表1 不同激光设备的参数

表2 红色毛癣菌在不同激光照射后产生的角蛋白酶活性比较

注：*表示与未照射组比P<0.05

图1Q开关Nd: YAG 532nm激光对红色毛癣菌菌落生长的作用图2Q开关Nd: YAG 1064nm激光对红色毛癣菌菌落生长的作用图3长脉宽Nd: YAG 1064nm激光对红色毛癣菌生长的作用图4585nm脉冲强光对红色毛癣菌生长的作用

Fig.1Effect of Q-switched Nd: YAG 532nm laser on the colony diameter ofTrichophytonrubrumat different energiesFig.2Effect of Q-switched Nd: YAG 1064nm laser on the colony diameter ofTrichophytonrubrumat different energiesFig.3Effect of long pulse width Nd: YAG 1064nm laser on the growth ofTrichophytonrubrumFig.4Effect of long pulse width 585nm intense pulsed light on the growth ofTrichophytonrubrum

3 讨 论

红色毛癣菌是引起甲真菌病最常见的病原菌。相比于药物，激光治疗几乎可以用于所有类型的患者，没有系统副作用，并且能避免耐药菌株的出现。既往研究资料表明高能量激光能有效治疗甲真菌病[7]，但低能量激光是否有类似作用尚不清楚。我们知道，低能量激光可能通过光激发效应对光敏感细胞产生光化学反应，而不出现热损伤。而高能量激光则通过热效应等损伤靶细胞活性,故如果低能量激光能达到杀死靶细胞从而抑制真菌生长,则治疗上更为方便。本研究中，我们用不同类型的激光器，不同的能量密度对红色毛癣菌进行照射，探讨不同能量不同激光对红色毛癣菌的作用。Nd: YAG激光是目前市面上比较常用的激光设备，临床研究发现它对甲真菌病有较好的疗效[8]。但脉宽、波长等参数是否也对菌落的抑制有不同的影响。因此我们尝试了不同脉宽(调Q和长脉宽)激光以及不同波长(1064nm和532nm)的激光。我们对脉冲强光波长的选择依据是，红色毛癣菌中的主要色素成分黄麦格霉素，对波长532～589 nm激光吸收较好[9]。本研究显示不同激光对红色毛癣菌生长影响不同：2～4J/cm2能量Q开关Nd: YAG 532 nm激光、4～8J/cm2能量Q开关Nd: YAG 1064 nm激光、4J/cm2长脉宽Nd: YAG 1064 nm激光对体外培养的红色毛癣菌有明显抑制作用。这与部分国外学者研究结果一致[10]。

Q开关Nd：YAG激光对真菌菌落的抑制作用很可能是由于非特定的热损伤以外的机制。532 nm Q开关Nd：YAG激光很好地被红色色素基团吸收，而红色毛癣菌正好含有丰富的黄麦格霉素，黄麦格霉素的存在使红色毛癣菌培养中显示红色。这种红色发色团的存在可以解释红色毛癣菌对532 nm激光的敏感性。

众所周知，38～47J/cm2的695～1000 nm波长范围的IPL系统和8～14 J/cm2的585 nm脉冲染料激光可以诱导明显热损伤[11]。本实验中585 nm激光对红色毛癣菌无明显生长抑制作用，提示该抑制作用可能主要是色素相关光热解的作用，而不是非特异性热损伤作用。尽管Q开关Nd：YAG 1064 nm波长超出了黄麦格霉素的吸收光谱，我们却观察到Q开关Nd：YAG 1064 nm对红色毛癣菌有类似的抑制作用。这可能是由于另一种色素基团，即红色毛癣菌细胞壁中含有的黑色素基团被1064 nm波长所吸收。

除了波长以外，Q开关Nd：YAG激光另一个重要特征是脉冲相对较短。这些短脉冲(纳秒级)会诱发微空化和声波冲击波，从而抑制真菌菌落。短脉冲时间(比热驰豫时间短得多)通过快速加热和冷却也会引起目标基团的热损伤。这些激光以相对长的脉冲传递时，不会发生极端的热循环和冲击波。国外学者使用2940 nm波长的 Er: YAG激光进行类似研究，未发现其对红色毛癣菌的生长抑制作用[10]。这可能提示了菌落抑制作用与非特异性热损伤或含水量无关。

角蛋白酶是红色毛癣菌侵入指趾甲的重要毒力因素[12]。有研究表明，指、趾甲作为底物诱导，能明显刺激红色毛癣菌产生角蛋白酶[13]。我们利用这一特性，用健康人甲作为诱生物，观察不同激光照射后红色毛癣菌产生角蛋白酶的改变情况。我们结果发现，中高能量Q开关Nd: YAG 532 nm激光和Q开关Nd: YAG 1064 nm以及高能量长脉宽Nd: YAG1064 nm激光照射红色毛癣菌后，其角蛋白酶的产生明显受抑制。这提示激光可能通过降低角蛋白酶活性而达到抑制红色毛癣菌生长的作用。但更多的可能机制有待更多的研究。

总之，本研究发现中高能量组的Q开关Nd: YAG 532 nm激光、Q开关Nd: YAG 1064 nm激光和高能量长脉宽Nd: YAG 1064 nm激光能明显抑制红色毛癣菌的生长及角蛋白酶的活性，后续将会筛查疗效更佳的激光设备及参数，同时将进一步探讨激光治疗甲真菌病可能的分子机制，为甲真菌病的治疗提供更多的选择方案。