栗方 李志荣 赵建宏 赵颖 张延海 董爱英 刘金禄 郭彦言 孙艳 赵文申 谢守军0 魏宏莲 张金艳 任宏涛 王建升 吴相锟 光晓 刘冬青 杜红丽 郭映辉 徐英春 肖盟 杨文航 徐晓琳

(1.河北燕达医院感染与疾病控制部，廊坊 065201；首都医科大学附属北京朝阳医院感染与微生物科，北京 100020；2.河北医科大学第二医院 河北省临床检验中心，石家庄 050000；3.中国医学科学院北京协和医院检验科 侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730；4.河北燕达医院，廊坊 065201；5.华北理工大学附属医院，唐山 063000；6.河北北方学院附属第一医院，张家口 075000；7.河北省唐山市工人医院，唐山 063000；8.沧州市中心医院，沧州 061001；9.邯郸市中心医院，邯郸 056001；10.承德医学院附属医院，承德 067000；11.河北医科大学第二医院，石家庄 050000；12.河北医科大学第四医院，石家庄 050019；13.邢台市人民医院，邢台 054001；14.河北省人民医院，石家庄 050057；15.河北省武安市第一人民医院，武安 056300；16.邯郸市第一医院，邯郸 056002；17.衡水市人民医院，衡水 053000；18.河北省儿童医院，石家庄 050030)

根据我国感染监测网的数据分析，医院真菌感染的发生率从20世纪90年代初的13.9%上升到90年代末的24.4%[1]，已经成为住院患者感染及死亡的重要并发症。国外相关文献报道，念珠菌的病死率为20%～63%，并随着患者的年龄增长而上升[2]，非白念珠菌引起的念珠菌菌血症越来越多[3]。国内钟南山[4]教授等研究显示，肺部念珠菌感染病死率30%～40%，肺部曲霉菌感染病死率50%～100%，而真菌血症的患者直接死于真菌感染或基础疾病可达50%以上。近年来，真菌感染的发病率呈逐年上升趋势，尤其是侵袭性真菌感染的发病率不断增高。在过去十年中，侵袭性真菌以念珠菌、曲霉菌为主[3]，死亡率高达40%～90%[6]。传统的形态学鉴定不能将一些罕见的丝状真菌和酵母菌准确鉴定到种，基于测序比对可作为真菌鉴定的金标准[7]。本研究收集2016～2017年河北地区16家三级教学医院侵袭性真菌菌株并进行统计分析，对侵袭性真菌感染分布特点进行回顾性调查，由中心试验室对疑难菌株进行质谱和分子生物学复核鉴定，为河北地区侵袭性真菌感染的诊断和治疗提供数据参考。

1 资料和方法

1.1 资料来源

收集2016～2017年河北地区16家三级教学医院门诊和住院患者分离的侵袭性真菌菌株，以及相关的一般临床资料与实验室信息，包括患者性别、年龄、病历号、科室(门诊、急诊或病房)、临床诊断、标本类型、分离部位、鉴定结果、鉴定方法等信息。

1.2 标本选择与菌株入组标准

侵袭性酵母菌标本类型包括：血液(导管血和外周血)、无菌体液(脑脊液、胸水、腹水、胆汁、关节液等)、脓肿(穿刺液)、组织标本、介入性操作标本(肺泡灌洗液、保护性毛刷)；剔除标本类型：痰标本及气管吸取物、尿标本及生殖道分泌物、同一患者7 d内同一部位重复分离的菌株。侵袭性丝状真菌标本类型包括：下呼吸道标本、耳道分泌物、眼分泌物、无菌体液(胸水等)、组织(肺等活检标本)、介入性操作标本(肺泡灌洗液等)；排除标本类型：同一患者7 d内同一部位重复分离的菌株。

1.3 主要仪器与试剂

沙堡弱培养基和马铃薯培养基、科玛嘉显色培养基(Chromagar)、YST酵母菌鉴定卡、Bact/Alert 3D 全自动血培养仪、VITEK-2 Compact 全自动细菌鉴定仪(法国生物梅里埃公司)、VITEK MS 微生物质谱仪(安图实验仪器郑州有限公司)。

1.4 菌种鉴定

酵母菌同时接种沙堡弱培养基、科玛嘉显色培养基。常规鉴定采用显色培养基、梅里埃API 20C、VITEK-2 Compact YST、美华真菌鉴定板、珠海迪尔真菌鉴定板。丝状真菌常规鉴定采用沙保弱培养基或者马铃薯培养基，进行乳酸酚棉兰染色，显微镜观察菌丝及顶囊形态等。判断标准参考临床微生物手册(第11版)及文献推荐方法。中心实验室对所有菌株进行Vitek MS复核鉴定，对于Vitek MS不能有效鉴定的菌株，进行核糖体DNA内转录间隔区ITS和/或钙调蛋白CaM区PCR扩增测序分析[8]。

1.5 参考菌株及质控菌株

ATCC90028白念珠菌，ATCC22019近平滑念珠菌，ATCC6258克柔念珠菌；CGCC3.772烟曲霉菌，CGMCC3.4410黄曲霉菌，CGMCC3.4523黑曲霉菌，CGMCC3.2822土曲霉菌。

1.6 诊断标准

侵袭性真菌病的诊断参照中华人民共和国卫生行业标准 WS/T497-2017《侵袭性真菌病临床实验室操作指南》。根据患者宿主因素、临床特征和微生物学检查，将侵袭性真菌病(IFD)诊断为确诊、拟诊和疑似[9]。侵袭性肺曲霉菌病的诊断参照欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组EORTC/IFICG确认的标准，以及中华医学会呼吸病学分会2007年制定的肺真菌病诊断和治疗专家共识[10]。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 检出情况

2016～2017年参与本研究的16家医疗机构共收集侵袭性真菌菌株493株。其中酵母菌268株(54.36%)，丝状真菌225株(45.64%)，见表1。

1*包括拟平滑念珠菌、日本毛孢子菌、果生念珠菌、解脂念珠菌、长路德酵母菌等。

2*包括日本曲霉、小孢根霉菌复合群、伞枝横梗霉、总状共头霉、波氏赛多孢霉等。

2.2 标本类型分布

侵袭性酵母菌共计268株，其中来自血液标本131株占48.88%，其次腹水、胸水、脓肿穿刺液、脑脊液。丝状真菌共计225株，其中下呼吸道痰标本197株(87.56%)，其次是肺泡灌洗液和耳道分泌物，见表2。

2.3 血标本和无菌体液标本侵袭性酵母菌感染检出情况

2016～2017年共收集侵袭性酵母菌268株，其中血标本131株，占48.88%；其他无菌体液标本137株，占51.12%。无菌体液白念珠菌检出率高于血标本，血标本近平滑念珠菌检出率高于无菌体液，P<0.05差异有统计学意义。其他酵母菌在血标本和无菌体液标本的检出率，差异无统计学意义，见表3。

2.4 科室分布

内科系统234株，占47.46%，主要包括呼吸科、血液科、肿瘤科、老年病科等。外科系统88株，占17.85%，主要包括普外科、神经外科、耳鼻喉科等；ICU 78株，占15.82%；其他部门93株，占18.86%。酵母菌和丝状真菌的科室分布存在差异，P<0.05有统计学意义，主要原因是与种群分布有关。酵母菌检出最高的科室是ICU，丝状真菌中检出率最高的科室是呼吸内科，见表4。

2.5 菌株鉴定复核结果

中心实验室对所有菌株进行Vitek MS质谱复核鉴定，对Vitek MS不能有效鉴定的菌株采用ITS、CaM区测序鉴定，评价各参与单位常规方法鉴定结果的准确性。各参与单位真菌复核正确率(373/493)75.66%，其中酵母菌复核正确率83.96%(225/268)，错误率为16.04%(43/268)。鉴定错误的酵母菌主要包括7株拟平滑念珠菌误判为近平滑念珠菌；5株热带念珠菌误判为光滑念珠菌；3株白念珠菌误判为都柏林念珠菌；3株热带念珠菌误判为白念珠菌，还包括一些少见的葡萄牙念珠菌、季也蒙念珠菌、Trichosporoncoremiiforme(目前暂无中文译名)、日本毛孢子菌、费比恩念珠菌、解酯念珠菌、果生念珠菌等。丝状真菌复核正确率(148/225)65.78%，错误率为34.22%(77/225)，鉴定错误的丝状真菌包括5株烟曲霉错误鉴定为土曲霉；2株黄曲霉错误鉴定为烟曲霉；3株烟曲霉错误鉴定为毛壳菌；10株烟曲霉错误鉴定为青霉属、小克银汉菌属、鬼伞、共头霉、链格孢霉属、根毛霉属、帚枝霉、尖端赛多孢子菌、毛霉菌、镰刀菌；3株黑曲霉错误鉴定为烟曲霉、黄曲霉和土曲霉；3株黄曲霉错误鉴定为构巢曲霉、镰刀菌属和橘青霉；2株构巢曲霉错误鉴定为木霉属和黄曲霉；2株米曲霉错误鉴定为烟曲霉和帚霉属；还包括米根霉、伞枝横梗霉、轮生镰刀菌、聚多曲霉、卷枝毛霉、冠状毛孢子菌等少见菌株。

表2 侵袭性真菌标本类型分布

1*包括胆汁、肺泡灌洗液、导管尖端、组织等，2*包括穿刺液等。

表3 血流感染和无菌体液感染检出构成比

*包括拟平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、葡萄牙念珠菌、阿萨希毛孢子菌、费比恩念珠菌、日本毛孢子菌、果生念珠菌、解脂念珠菌、长路德酵母菌等。

我们对微生物质谱MS不能有效鉴定的菌株，进行ITS和/或钙调蛋白测序分析，现将其中2株菌序列图展示如下。卷枝毛霉序列图，见图1；冠状毛孢子菌序列图，见图2。

3 讨 论

侵袭性真菌感染是指真菌侵入人体，在组织、器官及血流中生长、繁殖并导致炎症反应及组织损伤的疾病[11]。本研究中共收集侵袭性真菌菌株493株，主要以念珠菌为主的酵母菌和曲霉菌为主的丝状真菌。酵母菌中白念珠菌排在第一位，占41.79%，非白念珠菌占58.21%，非白念珠菌主要包括热带念珠菌(19.40%)、近平滑念珠菌(14.18%)、光滑念珠菌(10.82%)和新生隐球菌(3.73%)。CHIF-NET 2010-2014年中国多中心侵袭性酵母菌的研究报道[12-13]，白念珠菌仍然是最常见的菌种，占44.9%，但是非白念珠菌超过50%，其中近平滑念珠菌复合体20.0%、热带念珠菌17.2%、光滑念珠菌复合体10.8%，本研究结果与文献报道基本一致。深圳地区报道，流行的侵袭性真菌大多数是念珠菌，占总数的78.49%，尤其以白念珠菌为主(同类占比68.52%,总体占比53.78%)，其次是热带念珠菌、光滑念珠菌和克柔念珠菌[14]，所以不同地域间念珠菌分布存在差异。我们的调查显示酵母菌血流感染和无菌体液感染菌种分布存在差异，白念珠菌血流感染的检出率低于无菌体液，近平滑念珠菌血流感染检出率高于无菌体液，P<0.05有统计学差异。据报道[15]，一项33例腹腔念珠菌病的患者中，最常见的是白念珠菌，我们的研究与文献报道相同。本研究发现近平滑念珠菌和热带念珠菌是并列第二位的血流感染病原菌，CHIF-NET 2010-2014年的研究中近平滑念珠菌排在第二位或者第三位[12-13]。近平滑念珠菌典型的特征是可在葡萄糖溶液中生长，具有很强的产生生物膜的能力，且常定植在健康人皮肤上，往往因使用中心静脉导管或肠外营养，出现暴发性念珠菌菌血症[16]。

表4 主要科室不同侵袭性真菌检出构成比

*酵母菌其他部门包括：儿科、新生儿、妇产科、急诊科、烧伤科、感染科、五官科、皮肤科、疼痛科等；丝状真菌其他部门包括：儿科、感染科、急诊科、肾内科、消化内科、心胸外科、心内科、综合内科等。

图1卷枝毛霉ITS-HB16-55.ITS1.YP06066623.B05图2冠状毛孢子菌: ITS-NB16-47.ITS1.YP06083171.H07

Fig.1MucorcircinelloidesITS-HB16-55.ITS1.YP06066623.B05Fig.2Trichosporoncoremiiforme: ITS-NB16-47.ITS1.YP06083171.H07

我们的数据显示：丝状真菌中烟曲霉占59.11%，排在第一位，其次是黄曲霉/米曲霉(12.44%)和黑曲霉(8.00%)。国内栗方等[17-18]对53例侵袭性肺曲霉菌病研究显示，排在第一位的是烟曲霉菌，占59.68%,其次是黄曲霉占35.49%。国内其他学者报道[19]，痰液和耳道分泌物中检出最多的是曲霉菌，不同部位感染丝状真菌的临床特点和转归不同。当机体免疫机能受损，真菌易定植于呼吸道黏膜，且多见于高龄患者。很多患者因基础疾病入院后，长期使用抗菌药物造成呼吸系统菌群失调，易造成真菌的入侵或定植。丝状真菌容易在环境中生长繁殖，尤其是在潮湿的环境中。因此，临床在呼吸道标本中检出的丝状真菌，其临床意义和诊断价值很难明确，但不能轻易过早将其按照污染菌处理，应根据临床情况综合分析。本研究之所以纳入下呼吸道标本的丝状真菌，主要是为了加强基层医院真菌实验室的能力建设，了解丝状真菌的菌群分布，探索并完善鉴定方法。

监测显示：酵母菌中血液标本占48.88%，其次是腹水(17.54%)、胸水(10.45%)、脓肿穿刺液(5.97%)、脑脊液(4.85%)。CHIF-NET 2010～2014年中国多中心侵袭性酵母菌的研究报道[12-13]，酵母菌中血流标本最多占42.6%，其次是腹水19.4%。国内栗方报道[20]北京朝阳医院6年的临床研究显示，血液(35.14%)、腹水(35.03%)、胆汁(17.53%)、导管(6.50%)、胸水(5.80%)，我们的调查结果与报道基本一致。本研究丝状真菌主要分离自下呼吸道标本占87.56%，其次是肺泡灌洗液和耳道分泌物。国内一项关于丝状真菌的研究报道[19]，丝状真菌感染中50%分离自痰标本，表明呼吸道感染占主导，其次是耳内和眼角膜感染。

不同菌属真菌的科室分布存在差异，其中念珠菌主要分布在ICU，其次是内科系统和外科系统，与CHIF-NET 2010～2014年报道基本一致[12]。丝状真菌主要分布在呼吸科和ICU。

本研究在中心实验室对所有菌株进行Vitek MS质谱复核鉴定，针对Vitek MS不能有效鉴定的菌株采用ITS、CaM区测序鉴定。各参与单位真菌复核正确率75.66%，其中酵母菌复核正确率83.96%，错误率为16.04%；丝状真菌复核正确率65.78%，错误率为34.22%。本研究显示丝状真菌的错误鉴定率高达34.22%，与侵袭性酵母菌复核鉴定相比[21]，错误率更高，表明我们常用的基于形态学的丝状真菌鉴定方法还存在很大的局限性。目前河北地区开展真菌检测多数依赖基于生化反应的商品试剂盒，其中以VITEK-2 Compact最常见，但在鉴定疑难及罕见酵母菌方面的准确度明显下降[22-24]。

本研究是基于河北地区的一项多中心侵袭性真菌监测项目，可在相关方面提供充分、有效的数据，同时加强院感的动态监测，帮助临床医生了解院内真菌感染的菌种分布特点，为临床诊治提供依据。