王 彪 袁春雨 王沁澄 田播文 孙业祥

烧伤后的低血容量性休克极易引发肾功能急剧下降或急性肾功能衰竭。相关文献报道，成年烧伤患者早期急性肾损伤 （acute kidney injury，AKI）的发生率高达53.3%［1］，而合理的液体复苏能够减少肾损伤的发生［2］。研究显示，传统采用的乳酸钠林格注射液 （LR）虽可有效帮助重度烧伤患者度过休克期，但却存在增加低钠血症、组织水肿、腹腔间隔室综合征及免疫功能紊乱等并发症发生率的风险［3-4］；而高渗盐溶液 （HS，钠离子浓度为240～300 mmol／L）不但能够达到预期的复苏效果，而且还可降低患者的液体负荷及炎症反应程度，减轻脏器损伤［5-7］，且部分研究证实，高渗盐溶液可改善烧伤大鼠的肺损伤和肠损伤［8-9］。为此，笔者进一步研究了HS对重度烫伤大鼠肾损伤的影响，以期为HS的临床应用提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

健康雌性SD大鼠56只，体重 （230±15）g，均由安徽医科大学动物实验中心提供。本研究经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准，符合动物实验的伦理学要求。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 （neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）、 肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、 白细胞介素-6 （IL-6）、 高迁移率族蛋白 B1（high mobilitygroup bo1，HMGB1）试剂盒，以及p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases， p38 MAPK）相关抗体均由北京蒂诺奥生物科技有限公司生产。

1.2 模型建立与分组

大鼠于实验室中自由进食水，饲养1周后，按照随机数表法随机分为假伤组 （8只）、LR组 （24只）与HS组 （24只）。其中假伤组大鼠于10%水合氯醛 （0.3 g／kg）腹腔注射麻醉、背部脱毛及尾静脉置管处理后，背部脱毛处用温水做假伤处理后直接处死；LR组大鼠于10%水合氯醛 （0.3 g／kg）腹腔注射麻醉、背部脱毛及尾静脉置管处理后，背部脱毛处用95～100℃热水浸泡，建立面积为30%TBSA、深度为Ⅲ度 （经病理学检测，符合Ⅲ度烫伤的诊断标准）的烫伤模型，并根据Parkland公式［8］计算补液量进行LR复苏；HS组大鼠于烫伤模型建立 （方法同LR组）后，根据Parkland公式计算补液量进行 300 mmol／L（mM）HS（1L 300 mM HS含97 mL 10%NaCl和903 mL LR）复苏。

1.3 标本采集与指标检测

假伤组大鼠处死后取肾脏组织及腹主动脉血备用；LR组及HS组分别于复苏2、8、24 h后各取8只大鼠处死后取肾脏组织及腹主动脉血备用。

1.3.1 肾脏组织湿干重比值 （W／D）测定 大鼠肾脏组织于生理盐水冲洗、滤纸吸干水分后称取湿重；称取湿重后将组织标本放入75℃烤箱内烘烤72 h后取出称取干重；最后，计算肾脏组织W／D，并予以对比。

1.3.2 p38 MAPK水平检测 采用Western blot法对大鼠p38 MAPK的水平进行检测：将肾脏组织置于冰浴条件下，按照试剂盒说明书提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离后电转至硝酸纤维素膜上行5%脱脂牛奶封闭、p38 MAPK相关抗体4℃孵育过夜、二抗结合孵育及曝光显影，最后采用Image J软件分析目标条带，以磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）与p38 MAPK比值表示p38 MAPK通道活化程度。

1.3.3 血液指标检测 采用全自动生化分析仪检测腹主动脉血肌酐 （Cr）水平；按照试剂盒说明书采用ELISA法测定腹主动脉血血清NGAL、TNF-α、IL-6及HMGB1水平。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件对所得数据进行统计学分析，其中计量资料以均数±标准差 （±s） 表示，采用单因素方差分析和q检验；均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏组织W／D及p38 MAPK通道活

化程度对比

与假伤组对比，LR组及HS组大鼠伤后2、8、24 h肾脏组织W／D及p38 MAPK通道活化程度均较高，P均＜0.05，差异具有统计学意义。与LR组对比，HS组大鼠伤后2、8、24 h肾脏组织W／D及p38 MAPK通道活化程度均较低，P均＜0.05，差异具有统计学意义 （表1）。Western bolt法检测各组大鼠肾脏组织p-p38 MAPK及p38 MAPK水平条带见图1。

2.2 各组大鼠血液指标对比

与假伤组对比，LR组及HS组大鼠伤后2、8、24 h血清Cr水平均较高，P均＜0.05，差异具有统计学意义。LR组与HS组大鼠伤后2 h血清Cr水平对比，P＞0.05，差异无统计学意义；而伤后8、24 h，HS组大鼠血清Cr水平均低于LR组，P均＜0.05，差异具有统计学意义 （表1）。

与假伤组对比，LR组及HS组大鼠伤后2、8、24 h血清 NGAL、TNF-α、IL-6水平均较高，P均＜0.05，差异具有统计学意义。HS组大鼠伤后2、8、24 h血清 NGAL、TNF-α、IL-6水平均低于LR组，P均＜0.05，差异具有统计学意义 （表1）。

与假伤组对比，LR组及HS组大鼠伤后2 h血清HMGB1水平相同，P均＞0.05，差异无统计学意义；而伤后8、24 h血清HMGB1水平均较高，P均＜0.05，差异具有统计学意义。LR组与HS组大鼠伤后2 h血清HMGB1水平对比，P＞0.05，差异无统计学意义；而伤后8、24 h，HS组大鼠血清HMGB1水平均低于LR组，P均＜0.05，差异有统计学意义 （表1）。

3 讨论

研究显示，烧伤面积超过30%TBSA的患者可出现细胞外液、血浆白蛋白的大量丢失，进而诱发低血容量性休克、低蛋白血症而损伤肾脏功能，导致肾功能衰竭的发生［10-11］。而早期大量补充等渗晶体溶液虽能快速恢复循环血量，但也可加重脏器负担，引发组织水肿、低钠血症等并发症。HS作为一种单一渗透剂，可减轻机体负担，缓解脏器损伤［12-13］，鉴于此，笔者于本研究中探讨了其对重度烫伤大鼠肾损伤的影响。结果显示，重度烫伤大鼠应用HS后，肾脏干湿重比、p38 MAPK通道活化程度及部分炎症介质的表达水平虽较正常大鼠升高，但均明显低于应用LR治疗者，可见HS可减轻肾损伤。

Cr主要由肾小球滤过排出，当肾脏发生损伤时，可出现不同程度的Cr升高，因此Cr可作为反映肾功能的指标。NGAL在正常肾组织中处于低表达状态，急性缺血早期NGAL显著升高并对肾脏起到保护作用，因此，其高表达亦可作为肾损伤的标志［14-15］。本研究结果显示，LR组及HS组大鼠血清Cr及NGAL水平均显著高于假伤组，但HS组大鼠血清Cr及NGAL水平均显著低于LR组，表明HS可有效减轻肾脏的损伤程度［16］。

严重烧伤后，机体可产生大量炎症介质而诱发全身炎症反应，进而导致多器官功能衰竭。TNF-α是烧伤早期最重要的细胞因子，参与烧伤后炎症反应的调节［17］；IL-6是烧伤急性期的关键调节性细胞因子，可增强炎症反应程度，参与组织损伤和细胞死亡［18］；HMGB1作为转录增强核蛋白，能够促进 Kupffer 细胞分泌 TNF-α［19-20］。 本研究结果显示，LR组及HS组大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均显著高于假伤组，但HS组大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均显著低于LR组，表明HS可抑制TNF-α、IL-6、HMGB1的产生，减轻炎症反应程度，与Du Z等的研究结果一致［21］。

表1 各组大鼠肾脏组织W／D、p38 MAPK水平及血液指标对比 （±s）Table 1 Comparison of renal tissue W／D， p38 MAPK expression level， and blood indicators among the three groups （±s）

表1 各组大鼠肾脏组织W／D、p38 MAPK水平及血液指标对比 （±s）Table 1 Comparison of renal tissue W／D， p38 MAPK expression level， and blood indicators among the three groups （±s）

注：F1、P1为假伤组、LR组伤后2 h及HS组伤后2 h各项指标方差分析值；F2、P2为假伤组、LR组伤后8 h及HS组伤后8 h各项指标方差分析值；F3、P3为假伤组、LR组伤后24 h及HS组伤后24 h各项指标方差分析值。各时间点各项指标两两对比，其中与假伤组对比，aP＜0.05，差异具有统计学意义；与LR组伤后2 h对比，bP＜0.05，差异具有统计学意义；与LR组伤后8 h对比，cP＜0.05，差异具有统计学意义；与LR组伤后24 h对比，dP＜0.05，差异具有统计学意义Note： F1and P1were the ANOVA values of indicators at 2 h after scalds in each group； F2and P2were the ANOVA values of indicators at 8 h after scalds in each group；F3and P3were the ANOVA values of indicators at 24 h after scalds in each group.The pairwise comparison of all indicators among the three groups at the three different time points all showed statistically significant differences（aP＜0.05，bP＜0.05，cP＜0.05，dP＜0.05）

组别Group时间Time （h）只数Number of rats W／D p38 MAPK通道活化程度Activation degree of p38 MAPK channel Cr（μmol／L）NGAL（ng／mL）TNF-α（pg／mL）IL-6（pg／mL）HMGB1（pg／mL）假伤组Sham group 0 8 3.25±0.16 0.327±0.023 31.14±2.26 37.24±4.33 60.04±6.24 2.90±0.16 0.05±0.01 LR组LR group伤后2 h 2 h after scalds 8 3.86±0.28a 0.930±0.049a42.38±7.46a 93.83±9.21a122.74±13.61a5.43±0.24a 0.05±0.01伤后8 h 8 h after scalds 8 4.27±0.22a 0.946±0.057a 49.56±4.81a 111.42±7.18a153.21±13.45a6.12±0.39a 0.39±0.05a伤后24 h 24 h after scalds 8 3.90±0.28a 0.885±0.025a42.58±3.95a 93.86±7.70a 85.25±9.70a 5.87±0.36a 0.59±0.07a HS组HS group伤后2 h 2 h after scalds 8 3.43±0.14ab 0.568±0.020ab40.85±5.44a 74.53±5.45ab 84.84±3.60ab4.25±0.30ab 0.05±0.01伤后8 h 8 h after scalds 8 3.69±0.16ac 0.734±0.018ac41.49±2.32ac 83.25±6.72ac 93.71±5.53ac4.54±0.35ac 0.14±0.01ac伤后24 h 24 h after scalds 8 3.42±0.12ad 0.693±0.036ad36.64±1.76ad 70.09±7.50ad 67.50±4.38ad4.36±0.21ad 0.31±0.03ad F1value 19.074 663.945 9.871 149.029 100.919 222.074 1.000 F1值F2value 63.068 578.990 60.851 291.466 213.314 207.254 275.852 F3值F3value 23.034 787.239 32.999 144.463 26.444 265.582 296.678 P1值P1value 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.385 P2值P2value 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 P3值P3value 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 F2值

图1 Western blot法检测各组大鼠肾脏组织p-p38 MAPK及p38 MAPK水平条带图Fig.1 The expression levels of p-p38 MAPK and p38 MAPK in renal tissues of each group tested by the Western blot

MAPK信号级联通路的活化对细胞生长、发育及死亡的调节发挥着重要作用。p38 MAPK作为MAPK家族的重要成员之一，参与烧伤后炎症介质的生成。研究证实，p38 MAPK的激活是导致烧伤患者 TNF-α和 HMGB1升高的主要信号通路之一［22］；抑制p38 MAPK的活化可抑制IL-6和TNF-α mRNA的表达［23-24］。本研究结果显示，LR组及HS组大鼠肾脏组织p38 MAPK通道活化程度均显著高于假伤组，但HS组大鼠肾脏组织p38 MAPK通道活化程度显著低于LR组，表明HS可抑制p38 MAPK的 活 化， 进 而 减 少 TNF-α、 IL-6、HMGB1等炎症介质的产生，减轻肾脏的炎性损伤。

综上所述，HS可通过抑制炎症介质的产生及下调p38 MAPK信号通路而减轻肾脏的损伤程度［25-26］，故烧伤后可早期应用HS予以复苏抗休克。