陈虹

【摘  要】蔗糖-6-乙酯是制备三氯蔗糖的关键中间体，建立一种准确、快速的分析方法测定蔗糖-6-乙酯是这种甜味剂生产质控关键。采用高效液相色谱-蒸发光散射法（HPLC-ELSD）检测蔗糖-6-乙酯，使用ZORBAXSB-Aq色谱柱，以甲醇/水（5：90，v/v）为流动相，流速为0.8mL/min，蒸发光漂移管温度为85℃，氮气流速为1.5L/min。对外标法检测蔗糖-6-乙酯进行了方法学验证。两种方法的线性范围均为1.10～11.03mg/mL，线性相关系数均在0.99以上，其中外标法的RSD值均小于3.0%。这种方法能检测蔗糖-6-乙酯。本研究建立的方法可用于蔗糖-6-乙酯的含量检测，并为蔗糖酯的检测分析提供了参考。

【关键词】高效液相色谱法;测定蔗糖-6-乙酯;分析研究

[中图分类号]F66              [文献标识码]A

1材料与方法

1.1仪器与试剂

固定化疏棉状噬热丝孢菌脂肪酶（TLIM酶），250IUN/g，诺维信生物技术有限公司;蔗糖八乙酸酯，分析纯，纯度为98%，阿拉丁试剂有限公司;蔗糖-6-乙酯为实验室自制，纯度>95%;甲醇、乙腈为色谱纯，Sigma;蔗糖、乙酸乙烯酯、叔戊醇、二甲基亚砜均为化学纯。Agilent1200高效液相色谱仪，美国Agilent公司;Alltech3300蒸发光散射检测器，美国Grace公司;HH-4水浴恒温震荡器，金坛市江南仪器厂。

1.2试验方法

1.2.1样品的制备

称取10.3g蔗糖（0.3mol/L）、25.8g（3mol/L）乙酸乙烯酯、4gTLIM酶、1g4A分子筛于250mL具塞三角瓶中，再加入叔戊醇：二甲基亚砜（83：17）的溶剂，置于恒温摇床中，30℃、180r/min的条件下反应16h。反应结束后，反应液在3500r/min的条件下离心10min，取上清液，进液相分析，每组3个平行。

1.2.2高效液相色谱条件的选择

高效液相色谱法是一种较为普遍的分析方法，其分离度好、检测灵敏度高、方便快捷，通常与紫外检测器或示差折光检测联用。由于蔗糖与蔗糖酯不含发色团，因此用紫外检测器无法检测分离;示差折光检测器虽然对糖类的检测较为灵敏，但其容易受温度与流动相的影响，并且不适用于梯度洗脱。蒸发光散射检测器（ELSD）是近年来使用广泛的通用型检测器，其能检测不含发色团的化合物，适用于梯度洗脫，并且成本低、操作简单、不受温度影响。有文献报道糖类更适合用ELSD进行检测，其灵敏度高于示差折光检测器。通过先前试验室的研究基础得知，蔗糖-6-乙酯的检测采用ELSD，并以水作流动相，可以在20min内将产物和试剂洗脱。

2结果

2.1.1色谱柱的选择

选定HPLC条件为：检测器：ELSD;流动相：甲醇/水（10：90，v/v）;流速：0.8mL/min;柱温：30℃;进样量：5?L。蒸发光检测器温度：85℃;氮气流速：1.5L/min。分别考察ZORBAXSB-Aq（4.6mm×250mm，5?m）、ZORBAXSB-C18（4.6mm×250mm，5?m）、EclipseXDB-C18（4.6×250mm，5?m）、Extend-C18（4.6mm×250mm，5?m）对分离效果的影响。采用ZORBAXSB-C18、EclipseXDB-C18、Extend-C18柱的色谱图中蔗糖多酯峰形矮胖、分离效果不好，而ZORBAXSB-Aq柱不仅对蔗糖、蔗糖-6-乙酯和蔗糖多酯的分离效果都较好，并且保留时间较短，因此选择ZORBAXSB-Aq进行后续试验。

2.1.2流动相的选择

选定HPLC条件为：检测器：ELSD;色谱柱：ZORBAXSB-Aq（4.6×250mm，5?m）;流速：0.8mL/min;柱温：30℃;进样量：5?L。蒸发光检测器温度：85℃;氮气流速：1.5L/min。对超纯水、甲醇/水（5：95，v/v）、甲醇/水（10：90，v/v）、甲醇/水（15：85，v/v）、甲醇/水（20：80，v/v）、甲醇/水（30：70，v/v）六种流动相系统进行考察。随着流动相极性减小，保留时间变短，但各组分距离变近，分离度变小，分离效果不好。但考虑超纯水保留时间较长，最后选择甲醇/水（5：95）为流动相，来进行后续试验。

2.1.3柱温的选择

在2.1.2的试验条件下，分别考察柱温为：20、25、30、35、40℃时对分离效果的影响。随着温度的升高，蔗糖保留时间不变，蔗糖-6-乙酯保留时间变短，蔗糖多酯保留时间变长，同时蔗糖多酯的峰在30℃时分离效果较好，因此综合考虑最终选择柱温为30℃，进行后续试验。

2.1.4色谱条件的确定

蔗糖保留时间为3.732min，蔗糖-6-乙酯保留时间为7.143min，蔗糖多酯保留时间为17.272min。

2.2外标法

将不同浓度样品溶液进行HPLC分析，由于蒸发光散射检测器响应值与浓度关系较为复杂，查阅相关文献发现糖类或糖酯类的ELSD分析采用的线性关系主要有两种：浓度与峰面积直接作线性回归、浓度的对数与峰面积的对数作线性回归。于是对两种线性关系进行了比较，结果如图1所示。

结果表明将浓度与峰面积直接进行线性回归关系更加良好。上图表明，在1.10～11.03mg/mL的范围内，蔗糖-6-乙酯浓度与其峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为A=2427.8C-3355.4，相关系数为R2=0.994。

3讨论

本文对蔗糖-6-乙酯的检测分析方法进行了条件优化，建立了能够快速准确测定蔗糖-6-乙酯的高效液相色谱-蒸发光散射检测方法（HPLC-ELSD）。首次对检测蔗糖-6-乙酯所建立的分析方法进行了方法学验证，得到较好的结果。同时通过HPLC-ELSD进行外标法检测，结果表明这种方法各项指标都能满足试验室要求。外标法无需前处理，可以通过标准曲线直接计算含量，更简便快速;因此可以根据试验室条件与需求对进行选择。与现有的检测蔗糖-6-乙酯的分析方法相比，本文所建立的分析方法稳定、快捷、方便、准确，并且所做的方法学验证确保了该分析方法的可靠性，为蔗糖酯的检测分析提供了参考。

参考文献：

[1]安明哲，廖勤俭，李杨华，罗珠.高效液相色谱在白酒分析中的应用[J/OL].酿酒科技：1-4.

[2]黄鸾玉，杨姝丽，韦信贤，童桂香，吴祥庆，黄玉柳，蒙源.超高效液相色谱法测定水产品中喹乙醇的残留量[J].理化检验（化学分册），2019，55（04）：427-431.

（作者单位：浙江京新药业股份有限公司）